灵芝发酵液改善馒头品质的机制及漆酶基因在毕赤酵母内的异源表达
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能作用的底物非常广泛。漆酶能够催化氧化多种芳香族和非芳香族化合物使之生成相应的苯醌，同时把氧还原为水。目前研究表明，漆酶在造纸工业、食品加工、废水处理、土壤净化、染料脱色、生物传感器和免疫检测等方面都具有广泛的应用前景和较高的研究价值。 本论文利用单因素试验法对影响Ganoderma lucidum HSD06B液态发酵产漆酶的因素进行优化，得到菌株HSD06B发酵产漆酶的最佳培养基配方为:葡萄糖50 g/L，酵母膏20 g/L，藜芦醇0.7 mmol/L，KH2PO41g/L，CuSO4·5H2O0.4 mmol/L，麸皮15 g/L。菌株HSD06B利用该培养基在28℃、180 rpm、接种量10％的条件下发酵，第7天时漆酶酶活达到最高，为16540 U/L，比优化前提高了3.39倍。 灵芝漆酶粗酶液聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)实验表明，G.lucidum HSD06B漆酶包含三种同工酶，分别为Lac1、Lac2、Lac3。G.lucidum HSD06B漆酶酶学性质研究结果表明:该酶的最适反应温度为50℃，低于60℃保温1h仍能保存80％以上的酶活，具有良好的热稳定性，最适反应pH为4.5，在pH4.5-7.0时保温3h仍能保存80％以上的活力;金属离子Ca2+和Cu2+对漆酶酶活具有一定的激活作用，Cu2+的激活作用最为显著;K+、Mg2+、Na+、Mn2+、Fe2+和Zn2+对漆酶酶活有一定的抑制作用;米氏常数Km为1.852 mmol/L。 初步研究了灵芝发酵液对馒头品质的影响及其改善馒头品质的机制。结果表明灵芝发酵液可以改善馒头的比容，当发酵液添加量为100μL/g时，馒头的比容最大，为2.257mL/g;灵芝发酵液对馒头的气孔也有一定的改善作用，发酵液添加量为25μL/g时，气孔数达到最多，为1566，但是，随着添加量的继续增加，馒头的气孔面积则不断增大，至100μL/g时，气孔面积达到最大，为416.2 mm2;质构分析表明灵芝发酵液能增加馒头的硬度和咀嚼性，当发酵液添加量为50μL/g时，馒头的硬度和咀嚼度达到最高，分别为1998g和1579。灵芝发酵液中含有淀粉酶，淀粉酶能催化淀粉生成葡萄糖和麦芽糖，馒头发酵剂中的酵母菌利用葡萄糖和麦芽糖为碳源进行生长代谢会释放CO2，进而导致馒头的体积增大，比容也随之增加;同时，也会导致馒头气孔数和气孔面积的变化，馒头的气孔数和气孔面积随着发酵液添加量的增大逐渐增加，但是当发酵液添加量高于25μL/g时，淀粉酶活力过高，导致气孔数逐渐减少了，但是气孔却变大了，最终气孔面积变大;馒头的硬度和咀嚼度是由面粉中淀粉酶的作用、蛋白交联、淀粉中直链淀粉与支链淀粉的比例共同决定的，其中发酵液中漆酶催化蛋白交联、发酵液催化支链淀粉转化为直链淀粉可以导致硬度和咀嚼度增大，上述发酵液中淀粉酶的作用会导致硬度和咀嚼度的降低，当发酵液添加量≤50μL/g，前者占据主导作用，所以硬度和咀嚼度逐渐增大，发酵液添加量＞50μL/g时，淀粉酶活力较高，其影响作用占据主导，馒头硬度和咀嚼度逐渐减小，以上结果说明灵芝发酵液能显著改善馒头品质。 对灵芝漆酶基因进行克隆，经测序Lac基因编码区基因长度为1563 bp。对Lac基因密码子进行酵母偏好性改造，使漆酶基因在毕赤酵母中的表达水平在理论上得到显著提高。将改造后的Lac基因连接到表达载体pPIC9K上，得到重组质粒pPIC9K-Lac，通过LiCl转化法成功将改造后的Lac基因导入表达菌株毕赤酵母体内。Lac基因在毕赤酵母体内的表达及发酵条件的优化等工作将在以后的研究中进行。
灵芝;毕赤酵母;漆酶;液态发酵;馒头品质;异源表达
河南师范大学
硕士
微生物学
王海磊
2015
中文
TS213.2
75
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）