鸡粪中多重耐药细菌的分离鉴定及介导抗性基因水平转移元件的检测
由于抗生素在禽畜养殖、临床医药等方面的大量使用，近年来出现了大量的多重耐药细菌，但是，多重耐药菌产生的机制并不完全清楚。研究表明，质粒经常携带一些可移动的元件（如转座子），捕捉不同的抗性基因介导抗生素抗性基因的扩散，这被认为是多重耐药细菌产生的主要机制之一。本论文围绕质粒在环境抗生素抗性基因水平传播中所起的作用进行以下几方面的研究: 一、鸡粪中多重耐药细菌的分离鉴定及抗性检测。用含有庆大霉素、氯霉素、阿莫西林、头孢氨苄、环丙沙星、四环素、红霉素、卡那霉素这八种抗生素的培养基(LB培养基、SS培养基)，我们从一规模化养鸡场的鸡粪中筛选出35株多重耐药细菌。这些多重耐药细菌分布在13个不同的属，以革兰氏阴性细菌为主导。在LB培养基中G-细菌与G+细菌分别占63％和37％，在SS培养基中G-细菌与G+细菌分别占87％和13％。这些细菌中对红霉素具有耐药性的最多，对阿莫西林具有耐药性的最少，它们分布于变形菌门、放线菌门以及厚壁菌门。抗生素抗性基因常与重金属抗性基因定位在同一个遗传元件上，我们将没有抗生素抗性的大肠杆菌与2株耐8种抗生素细菌进行对比实验。结果表明，这些多重耐药菌对Zn、Pb、Cu、Mn的抗性比没有抗生素抗性的细菌强。 二、多重耐药细菌质粒的检测及遗传特性研究。我们提取了各多抗菌的抗性质粒并转化入模式菌株DH5a中。进一步检测发现，这些多抗菌中均有一大小在15kb左右的质粒被成功转入DH5a中。携带该质粒的DH5a可以在加有四环素、卡那霉素、头孢氨苄的LB固体培养基上生长，这表明该质粒上可能携带这三种抗生素抗性基因。测序结果显示，该质粒大小为14591bp，将其与NCBI中现有质粒进行同源性对比分析，发现其与一植物双元穿梭表达载体pZGA22的相似度达到99％。通过生物信息学分析，我们发现其携带编码四环素类（tetR_C、tetR_N）、磷酸转移酶类(NTPⅡ、NTPⅢ)抗性基因以及一个能同时控制多种抗生素抗性和重金属抗性的超家族域Glo_EDI_BRP。这些结果表明，该质粒很可能具有介导环境中多种耐药基因（包括多种重金属抗性基因）发生水平转移的能力。 三、质粒的水平转移情况研究。首先，我们对不同多抗菌中15Kb大小质粒进行胶回收后酶切。酶切后的电泳图谱显示，这些质粒很可能是同一个质粒。接下来，我们根据该质粒的全序列设计12对引物，对其进行PCR扩增测序与拼接。结果显示，存在于干燥棒状杆菌Corynebacterium xerosis、河流漫游球菌Vagococcus fluvialis、大肠杆菌Escherichia coli、变形杆菌Proteus sp.、小鳟鱼大洋芽孢杆菌Oceanobacillus oncorhynchi、柠檬酸杆菌Citrobacter sp.中的15Kb大小质粒确为同一质粒。因此，这一15Kb大小质粒是环境中介导抗生素抗性基因发生水平转移的一个重要载体，它可能携带多种抗性基因在不同种属细菌中进行水平转移。
质粒;多重耐药细菌;抗生素;抗性基因;分离鉴定;水平转移
河南师范大学
硕士
生物学、微生物学
杨清香
2015
中文
R446.5
92
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）