高产油脂和类胡萝卜素红酵母的选育
目前，随着人口的不断增长，油脂需求量日益增加，动植物油脂已经不能满足人类的需要。微生物油脂是继动植物油脂之后的又一油脂新资源，它们大多数富不饱和脂肪酸，具有促进人类健康的重要作用。同时，它也可以作为生产生物柴油的原料。因此，开发高产油脂微生物资源在食品保健以及生物柴油生产等方面将具有十分重要的现实意义。 类胡萝卜素作为一类具有重要功能的脂溶性色素，广泛分布于自然界中，其营养丰富，具有抗癌、抗氧化、抗心脑血管疾病等功效，因此，已被广泛应用到食品，饲料、保健品及化妆品等行业。尽管许多研究者已经对如何提高类胡萝卜素的产量进行了大量的研究，但是，到目前为止，类胡萝卜素的产量和质量仍远远不能满足人们的需求。 在本研究中，我们从实验室保藏的酵母菌中筛选得到一株油脂产量和类胡萝卜素产量均较高的菌株KC8，通过诱变育种以及构建基因工程菌等手段分别获得了油脂产量和类胡萝卜素产量明显提高的菌株，并利用所构建的基因工程菌研究了添加酮康唑对红酵母发酵产类胡萝卜素的影响。主要创新性研究结果有如下几方面: (1)以KC8为出发菌株，经ARTP诱变，最终从300株诱变存活菌株中筛选得到高产油脂突变菌株Y3，经96 h摇瓶发酵培养后，油脂产量为2.38 g/L。对菌株Y3的培养条件进行优化，菌株在葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，碳氮比为90∶1，培养基初始pH为6.5时，在28℃的条件下摇瓶发酵培养96 h后，油脂产量最高达到了3.96 g/L;GC-MS分析结果表明，该脂肪酸主要由棕榈油酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸组成，与植物油成分相似。 (2)以KC8为出发菌株，依次经ARTP诱变、亚硝酸钠诱变、紫外诱变、紫外-亚硝酸钠复合诱变。最终从800株诱变存活菌株中筛选得到高产类胡萝卜素突变菌株K4，产量为14.47 mg/L，为出发菌株的1.67倍，高效液相色谱(HPLC)分析表明，该菌株所产类胡萝卜素的主要成分为β-胡萝卜素。 (3)以KC8诱变获得的高产菌株K4为基础通过导入并过表达类胡萝卜素合成过程中的关键酶基因（HMG CoA还原酶）获得了产量进一步提高的基因工程修饰菌株G1。重组酵母G1的类胡萝卜素产量最高达到17.02 mg/L，相比诱变后的红酵母K4产量又提高了17.9％。本研究有别于常规的在遗传信息明确的菌株中导入类胡萝卜素合成基因，而是在野生菌株K4中通过过表达HMG CoA还原酶基因，增加类胡萝卜素前体物IPP（异戊烯焦磷酸）的合成量，进而提高类胡萝卜素的产量。首先从酿酒酵母基因组中扩增得到1596 bp HMG CoA基因片段，从胶红酵母KC8基因组扩增得到2段具有不同酶切位点的663 bp5.8S-ITS rDNA序列。以来自质粒p416 GPD的强启动子GPD为启动元件，博来霉素抗性为筛选标记，以扩增得到的两段rDNA作为同源整合位点，HMG CoA片段为要表达的目的基因，成功构建了胶红酵母整合性重组表达载体pPIC-2rDNA-G-H-C。然后通过电转化的方法将表达载体转化进入红酵母K4中，筛选得到一株高产色素的转化株G1。 (4)酮康唑属于麦角固醇抑制剂。在重组酵母G1类胡萝卜素发酵培养过程中加入酮康唑，会影响其类胡萝卜素产量。通过优化酮康唑添加时间和添加剂量获得最佳加入时间为菌株发酵培养24 h后，最佳添加剂量为达到培养液终浓度28 mg/L时，加入酮康唑之后G1的类胡萝卜素最终产量可达19.14 mg/L。
类胡萝卜素;微生物油脂;红酵母;ARTP诱变;关键酶基因
河南师范大学
硕士
生物学、微生物学
杨清香
2015
中文
TQ920.1
100
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）