酶偶联法催化还原潜手性酮类化合物的研究
醛酮还原酶作为催化剂制备手性化合物时，合成产物的同时会消耗掉一定量的辅酶。而这些辅酶往往比所制备的产物还要昂贵，稳定性差，难以重复利用。在工业化生产中，不可能投加大量的辅酶，所以高效辅酶再生系统的构建和辅酶的反复使用是当下必须解决的问题。 为了解决辅酶再生问题，本文利用基因工程的方法，以洛德酵母的基因组为模板，经过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到甲酸脱氢酶(FDH)基因，与载体pET28a成功构建了重组质粒pFDH-pET28a，并转化入E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coli BL21-FDH。分别考察了温度，浓度和时长对此蛋白酶可溶性表达的影响，并测得甲酸脱氢酶的酶活。 利用构建的高效辅酶再生系统，制备两种医药中间体:L-2-氨基丁酸和(S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。 分别构建了苏氨酸脱氨酶(TD)表达质粒pTD-pET28a和亮氨酸脱氢酶(LDH)表达质粒pLDH-pET21a。将pTD-pET28a转化入E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coliBL21-TD，测得苏氨酸脱氨酶的酶活。将重组质粒pFDH-pET28与pLDH-pET21a共同转化入E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coli BL21-FDH/LDH。测得亮氨酸脱氢酶的酶活。利用酶偶联法制备L-2-氨基丁酸，探索并确定了此转化反应的最适条件:温度、pH、氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的初始浓度、最大底物投料量、酶加量配比和最终反应时长等。同时探索并确定了L-2-氨基丁酸的最佳纯化条件:温度、pH和醇洗次数等。质谱(MS)，核磁(NMR)和旋光检测证明此反应催化得到的产物为L-2-氨基丁酸。最终产物纯度为97％，收率为80.65％，已达到后续实验的要求。 构建了乙醇脱氢酶(ADH)表达质粒pADH-pET21a，与pFDH-pET28a共同转化入E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coli BL21-FDH/ADH。测得乙醇脱氢酶的酶活。利用酶偶联法制备(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇，探索并确定了转化反应的最适条件:温度、pH、最大底物投料量、最佳助溶剂和最终反应时长等。采用柱层析法纯化产物。质谱，核磁和旋光检测证明此反应催化得到的产物为(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇。最终产物纯度为100％，收率为50％以上，已达到后续实验的要求。 通过L-2-氨基丁酸和(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的制备，表明本文中构建的辅酶再生系统的有效性。
潜手性酮类化合物;酶偶联法;催化还原;基因工程;可溶性表达
河南师范大学
硕士
应用化学
梁蕊
2015
中文
O622.4;O643.32
78
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）