铁对Caco-2细胞及肉仔鸡锰吸收的影响及其机制
本论文通过两个试验分别研究了铁对Caco-2细胞及肉仔鸡锰吸收的影响及其机制。 试验一、研究了铁处理对Caco-2细胞锰吸收的影响及其机制。本试验包括2个小试验。 试验1、研究了不同接种密度对Caco-2细胞吸收模型分化及去极化评价指标的影响，确定了细胞模型适用于吸收和转运试验的时间。将Caco-2细胞按高密度(1×105cells/cm2)、中密度(5×104cells/cm2)和低密度(3×104cells/cm2)三个接种密度，分别接种于带聚碳酸酯微孔滤膜插槽的Transwell6孔板上，培养29天，通过测定跨膜电阻值(TEER)、碱性磷酸酶活性(ALP)和酚红透过率，评价细胞单层的完整性、极化和透过性。结果表明:高、中、低密度接种分别于第12、15和18天TEER值超过600Ω/cm2，第27、29和29天TEER值开始下降;高、中、低密度接种分别于第15、18和21天上、下侧碱性磷酸酶活性的比值达到10倍以上，第29天开始降低;高、中、低密度接种分别于第9、12和15天酚红透过率小于0.5％。综合上述三项指标，高密度接种细胞在第15天、中密度接种细胞在第18天、低密度接种细胞在第21天开始，可以用于吸收和转运试验，27天以后细胞活力就开始下降，不适合做吸收和转运细胞模型。 试验2、研究了铁处理对Caco-2细胞锰吸收的影响及其机制。采用单因子完全随机试验设计，共5个处理组，分别为正常含血清培养基、正常含血清培养基加铁100μmol/L、正常含血清加铁200μmol/L、无血清培养基添加铁100μ mol/L和无血清培养基加铁200μ mol/L，每个处理6个重复。分别在细胞培养的第18～23天在培养基里以次氮基三乙酸络合铁的形式添加铁，铁处理120h结束后，在所有细胞培养液中以无机硫酸锰的形式添加800μ mol/L锰，37℃、50r/min水浴振荡器上振荡孵育120 min，收集细胞及上、下层培养液，测定其中铁和锰含量;分别在铁处理72和120h后收集细胞，测定二价金属转运蛋白1(DMT1)、膜转铁蛋白1(FPN1)和十二指肠细胞色素还原酶b(Dcytb)mRNA及蛋白表达量。结果表明:与不加铁对照组相比，无血清培养基中添加铁处理组细胞中铁含量显著高于对照组(P＜0.09)，有血清培养基中添加铁处理组细胞中铁含量无显著提高(P＞0.31);无血清培养基中添加铁处理组和有血清培养基中添加铁200μmol/L处理组细胞对锰的摄取量(P＜0.03)和吸收量(P＜0.02)均显著降低;铁处理72h有血清培养基中添加铁对DMT1 mRNA(P＞0.38)和FPN1(P＞0.43) mRNA无显著影响，铁处理120h有血清培养基中添加铁200μmol/L和无血清培养基中添加铁组DMT1(P＜0.01)和Dcytb mRNA(P＜0.05)水平均显著降低，无血清培养基中添加铁处理72和120h均显著降低DMT1(P＜0.01)和FPN1(P＜0.05) mRNA水平，对Dcytb mRNA水平无显著影响(P＞0.14);铁处理72和120h对FPN1蛋白表达量均无显著影响(P＞0.89)，无血清培养基中添加铁组DMT1蛋白表达量显著降低(P＜0.08)，有血清培养基中添加铁组DMT1蛋白表达量无显著变化(P＞0.44)。本研究结果提示，血清影响铁处理细胞对锰的摄取和吸收以及细胞中DMT1、FPN1和Dcytb的表达，铁处理细胞中DMT1和FPN1基因表达水平降低伴随着摄取和吸收锰量的降低，表明铁通过DMT1和FPN1调控细胞对锰的摄取和跨膜吸收。 试验二、研究了铁处理对肉仔鸡锰吸收的影响及其机制。采用单因子完全随机设计，共4个处理组，分别为不加铁基础饲粮组(0mg/kg)、以硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)形式添加100、250和500mg/kg组。将336只1日龄商品代罗斯308肉公雏，按体重随机分为4个处理组，每组6个重复，每个重复14只鸡，饲养至28日龄。分别在8、15、22和28日龄早晨空腹称重、采血和屠宰取组织器官。28日龄对添加铁水平为100和500mg/kg组鸡进行原位结扎十二指肠灌注8.74mmol/L锰。结果表明，除添加铁500mg/kg组1～14日龄日增重(P＜0.10)及1～7日龄采食量显著(P＜0.03)显著低于对照组外，饲粮铁水平对其他各周生长性能指标无显著影响(P＞0.16);饲粮铁水平对各周龄血浆总铁结合力、血红蛋白浓度及红细胞压积均无显著影响(P＞0.16)，但显著影响血浆铁和血浆转铁蛋白饱和度(P＜0.09)，且各周龄血浆铁和血浆转铁蛋白饱和度均随饲粮铁水平增加而提高(P＜0.01);饲粮铁水平除对第21和28日龄心脏铁含量无显著影响(P＞0.23)外，显著影响第7和14日龄心脏及各日龄肝脏、十二指肠、胰腺和骨灰铁含量(P＜0.02)，且这些组织铁含量均随饲粮铁水平增加而提高(P＜0.01);除各日龄肝脏和心脏锰含量无显著变化外(P＞0.13)，各日龄十二指肠、胰腺和骨灰锰含量均随饲粮铁水平增加而降低(P＜0.01);饲粮添加铁除降低第7日龄胰腺锌含量外(P＜0.01)，对其他日龄胰腺和各日龄其他所测组织锌含量、各日龄所测组织铜含量均无显著影响(P＞0.13);饲粮铁水平显著影响各日龄十二指肠粘膜DMT1和FPN1 mRNA水平(P＜0.10)，各日龄DMT1和FPN1 mRNA水平均随饲粮铁添加水平升高而降低(P＜0.10);饲喂添加铁500 mg/kg饲粮组肉仔鸡原位结扎十二指肠中锰的吸收率明显低于饲喂添加铁100 mg/kg饲粮组(P＜0.04)。本试验结果提示，饲粮铁通过调控十二指肠粘膜DMT1和FPN1的表达影响肉仔鸡对锰的吸收。 综上所述，体外细胞培养Caco-2细胞和肉仔鸡饲养及灌注均表明，铁处理通过调控细胞或肠道DMT1和PFPN1基因表达降低锰的摄取和吸收，从分子水平揭示了铁对锰吸收的影响及其机制，为进一步研究锰吸收的分子机制奠定了基础。
铁元素;Caco-2细胞;肉仔鸡;锰吸收
河北科技师范学院
硕士
动物学
李素芬
2015
中文
S831.4
57
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）