非小细胞肺癌细胞及其顺铂耐药细胞株DNA和组蛋白表观遗传差异的研究
目的：探讨非小细胞肺癌及其顺铂耐药细胞株DNA和组蛋白的表观遗传学差异。 方法：选取野生型非小细胞肺癌细胞株A549和H838细胞株，采用逐渐增加顺铂浓度并大剂量冲击相结合的方法诱导非小细胞肺癌细胞株的耐药细胞群，诱导后继续在正常培养液中培养21天，分别在诱导后第1天、6天、11天、16天和21天，收细胞提取DNA、RNA和蛋白，行如下检测：MSP研究DNMT1基因和DNMT3b基因启动子区域甲基化状态；染色体免疫共沉淀(ChIP)研究DNMT1基因、DNMT3b基因、H3K4Me2和H3K9Me2的关系；Infnium研究基因组甲基化状态，根据甲基化变化适当调整检查的时间点；荧光定量PCR(qRT-PCR)研究DNMT1、DNMT3b和MDR1的mRNA表达；流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡；Western blotting检测DNMT1、DNMT3b和MDR1蛋白表达，其中DNMT1和DNMT3b的表达包括全细胞、胞浆、胞核内游离蛋白和结合于染色体的蛋白；CCK-8检测细胞生长活性。 结果：⑴两株非小细胞肺癌细胞株经30周顺铂诱导，最终可于目标顺铂浓度2.0ug/ml的培养液中稳定增殖，表明细胞株顺铂耐药诱导成功。⑵顺铂耐药细胞株脱离顺铂培养后在不同的时间点收集样本检测发现，随着去药物培养时间的增加，Western blotting，qRT-PCR, ChIP, MSP, Infinium，DNMT1、DNMT3b基因甲基化水平降低，使该基因mRNA，蛋白，组蛋白以及整体基因组甲基化水平表达均出现先递减后递增的一致趋势，并且能导致细胞周期阻滞，细胞增殖能力亦可先减弱后增强。 结论：①非小细胞肺癌细胞株经诱导顺铂耐药后，能逆转DNMT1、DNMT3b甲基化状态，进一步说明表观遗传可以逆转的性质，为临床长期进行表观遗传治疗提供依据。②非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株DNMT1、DNMT3b基因的mRNA、蛋白表达趋势和在细胞周期的不同时间点出现周期阻滞与这两个基因启动子区的甲基化状态有着较为密切的联系，表明表观治疗药物对DNMT1、DNMT3b的抑制作用主要体现在抑制其生成。③DNMT1、DNMT3b基因可能是非小细胞肺癌顺铂耐药发生、发展中的一个重要因素，为非小细胞肺癌的表观遗传学的分子靶向治疗提供新途径。
肺腺肿瘤;药物化疗;顺铂耐药;DNA甲基化
桂林医学院
硕士
心胸外科
宋剑非
2015
中文
R734.2;R730.53
81
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）