绿色荧光蛋白标记结合SEM/EDS技术观测兔BMSCs体外矿化的研究
目的：观察绿色荧光蛋白(GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨诱导后形态学改变及体外成骨中矿化钙结节的形成，并结合扫描电镜和X射线能谱分析(SEM/EDS)技术对矿化钙结节进行微观形貌观察和定量能谱分析，并对GFP标记的兔BMSCs复合脱钙骨(DBM)支架体外构建组织工程骨表面进行微观形貌和生物矿化进行观测。 方法：用携带GFP基因的腺病毒(Ad-GFP)转染兔BMSCs进行示踪标记，并诱导细胞向成骨方向分化，通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察成骨诱导后细胞形态改变和矿化钙结节的形成，结合SEM/EDS技术观测矿化钙结节的表面微观结构及其元素构成。用GFP标记的BMSCs与DBM复合经成骨诱导后，通过倒置荧光显微镜对细胞生长情况进行即时观察，结合SEM/EDS技术观测组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化。 结果：Ad-GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光，经成骨诱导后细胞形态向成骨方向分化，并形成不透光的矿化钙结节，钙结节茜素红染色见红色矿化结节，电镜下见矿化钙结节散布于细胞中，细胞重叠生长，分泌基质旺盛。X射线能谱分析显示矿化钙结节主要组成元素与正常骨组织相同，其钙磷比(Ca/P)为1.55，接近正常骨组织钙磷比1.49。用GFP标记的BMSCs与DBM复合体外构建组织工程骨，经成骨诱导后，在倒置荧光显微镜下见细胞在DBM支架上能较好的黏附、重叠生长和增殖，体外培养至14天时，细胞内GFP有较高水平瞬时表达。电镜下见DBM呈疏松多孔结构，孔隙直径在300～600μm之间，孔隙率达90％。电镜下观察组织工程骨，见细胞在DBM网孔内表面贴壁生长，分泌基质旺盛，并可见粗糙的生物矿化物覆盖支架。用X射线能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物，其钙磷比(Ca/P)为1.46。 结论：Ad-GFP能成功转染并标记兔BMSCs，并能直接动态即时观察BMSCs的成骨分化过程中的细胞形态改变和空间分布;成骨诱导后BMSCs向成骨方向分化，具备较好的成骨能力;BMSCs体外矿质化成骨过程与体内基本相同;BMSCs与DBM复合体外构建组织工程骨有较好的生物性能。
骨骼修复;生物材料;复合脱钙骨;细胞生物学
桂林医学院
硕士
外科学
李强
2015
中文
R318.17;R318.08
58
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）