氧环境通过FNR蛋白调控大肠杆菌SM10接合反应的机制研究
目前从临床分离的耐药性致病菌中检测到种类不同的耐药基因，说明细菌间的耐药基因水平转移(HGT)是导致耐药性加剧的重要原因。细菌之间耐药基因水平转移有转导、转化和接合三种方式，而接合(conjugation)是耐药基因水平转移的一个主要方式。接合是通过性菌毛互相沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌的过程。由于在多种细菌间均能稳定存在，多年以来宽宿主质粒RP4一直是研究细菌间接合的模式质粒。为了利用RP4质粒的基因转移功能将大肠杆菌中的基因转移到其他革兰氏阴性菌，同时避免RP4质粒的自我转移，R.Simon等将RP4质粒整合到了大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) S49-20(recA-)基因组上，构建了接合菌株SM10。本课题组在前期小鼠实验中发现氧环境对E.coli SM10与铜绿假单胞菌(PA)PAO1之间接合反应的接合效率产生影响。本实验进一步探索氧这一环境因素对接合反应的调控机制。 首先，从接合频率的表型上，试验以大肠杆菌SM10作为接合的供体菌，分别以PAO1和EC600作为受体菌，发现无论是滤膜杂交法还是液体接合法，厌氧条件下的接合效率都会明显低于有氧条件下的接合效率。 继而本实验探索了氧环境对接合反应调控的分子机制。实验从大肠杆菌转录因子系统着手，探究了是否存在大肠杆菌SM10的转录因子能够对整合质粒RP4进行调控从而影响SM10的接合功能。大肠杆菌的FNR(fumarate and nitrate reduction)蛋白是细菌厌氧环境下的全局调控转录因子，属于大肠杆菌单组分调控系统[4]。在厌氧环境下，大约有三分之一的大肠杆菌基因表达与在有氧环境下不同，在这些基因中又有712(49％)个受到FNR蛋白直接或者间接的调控[5]。由此，实验采用Red同源重组技术突变缸基因，建立SM10△fnr基因突变株，并分别以SM10和SM10△fnr为供体菌，PAO1和EC600为受体菌，然后再分别进行有氧、厌氧接合。结果显示在有氧环境下，fnr基因突变株与受体菌PAO1或EC600的接合效率均升高;在厌氧环境下，fnr基因突变株与PAO1的接合效率降低，但与EC600的接合效率升高。 最后，实验通过琼脂糖凝胶迁移实验发现FNR蛋白能在体外结合RP4质粒korC基因启动子区域，提示fnr通过korC调控RP4质粒接合反应。 综上所述，本实验探索了氧环境对大肠杆菌SM10接合反应的调控机制，发现氧环境可以通过FNR蛋白调控SM10接合反应，为以后更全面地探索接合反应提供了新的研究思路。同时因为接合又是耐药基因水平转移的一个重要方式，本研究结果同时对耐药基因转移的研究开辟了新的方向。因此，本实验具有一定的科学价值和临床意义。 目的:探索氧环境对大肠杆菌SM10接合反应的调控机制 方法: 1.滤膜杂交法[6]接合反应和培养基液体接合反应 将pUCP30T质粒转化进E.coli SM10培养为供体菌，铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌EC600为受体菌，分别以滤膜杂交法和液体接合法进行接合实验研究氧环境对接合频率的影响。 2.SM10中fnr基因的缺失突变 利用Red同源重组的方法将大肠杆菌SM10中的fnr基因缺失突变 3:fnr突变对SM10接合频率频率的影响 将pUCP30T质粒分别转化进E.coli SM10和E.coli SM10△Fnr中，转化成功的两细菌均做有氧(aerobic)培养为供体菌，铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌EC600为受体菌，两组分别做有氧和厌氧(anaerobic)接合，并分别以滤膜杂交法和液体接合法进行接合实验研究氧环境和Fnr对接合频率的影响。 4.fnr突变对接合相关基因的影响 采用荧光定量PCR分别检测E.coli SM10(pUCP30T)和E.coliSM10△fnr((pUCP30T)在有氧和厌氧培养条件下接合相关基因的表达，观察氧环境和fnr突变对接合相关基因的影响。 5.琼脂糖凝胶迁移实验 通过构建Fnr原核表达载体，表达纯化回收Fnr蛋白，与DNA探针进行琼脂糖凝胶迁移实验。 结果: 1.以大肠杆菌SM10作为接合的供体菌，分别以PAO1和EC600作为受体菌，无论是滤膜杂交法还是液体接合法，厌氧条件下的接合效率都会明显低于有氧条件下的接合效率。 2.成功构建fnr敲除菌SM10△fnr。 3.在有氧环境下，突变fnr基因后SM10-PAO1与SM10-EC600的接合效率都会升高。在厌氧环境中，突变fnr基因后SM10-PAO1的接合效率降低， SM10-EC600的接合效率升高。 4.fnr基因突变后，无论有氧接合还是厌氧接合，所有的接合相关基因，包含所有的全局调控基因以及下游的功能基因表达量均下降。另一方面，KorA、korB及其下游基因traI的表达量厌氧接合时相对于有氧接合时会下降。KorC及其下游基因kleC、trbA及其下游基因trbE的表达量厌氧接合时相对于有氧接合时会上升。 5.琼脂糖凝胶迁移实验显示，Fnr蛋白能在体外与korC启动子DNA序列结合。 结论:本实验本实验探索了氧环境对大肠杆菌SM10接合反应的调控机制，发现氧环境可以通过FNR蛋白调控SM10接合反应。Fnr抑制接合反应，突变fnr基因后接合效率升高。
大肠杆菌;接合反应;氧环境;转录因子;蛋白调控
广州中医药大学
硕士
临床检验诊断学
陈茶
2015
中文
R378.21;R446.5
48
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）