树豆酮酸A对PTP1B过表达HepG2细胞胰岛素信号通路的作用研究
Ⅱ型糖尿病也称非胰岛素依赖型糖尿病，是一种危害严重的疾病。近年由于人们生活方式的改变使Ⅱ型糖尿病的发病率不断增加，甚至有发病年轻化的趋势。胰岛素抵抗(IR)是Ⅱ型糖尿病主要的病理特征和发病机制，与Ⅱ型糖尿病及其并发症的发生发展密切相关。预防和治疗胰岛素抵抗是治疗糖尿病和预防糖尿病并发症的重要环节之一。 实验目的:本课题组前期在树豆中分离的树豆酮酸A(CAA)是一种全新的蔗类化合物，在体内研究发现其对Ⅱ型糖尿病大鼠模型等糖尿病动物模型具有降低血糖，增强胰岛素敏感性的作用;体外研究发现其可以抑制脂肪细胞分化，改善地塞米松诱导的胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖吸收。为了进一步研究树豆酮酸A的药理作用，本实验以胰岛素信号通路负性调节因子——蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)为靶点，采用PTP1B过表达肝细胞模型，评价树豆酮酸A对PTP1B的表达和活性的抑制作用，对胰岛素信号传导通路的调控作用，以及改善胰岛素抵抗、调节糖代谢的作用，为树豆酮酸A用于治疗Ⅱ型糖尿病的开发提供实验依据。 实验方法:树豆酮酸A对PTP1B活性的作用:以磷肽IR5（胰岛素受体β亚基氨基酸1142-1153）为底物，通过比色法检测磷酸基团的释放来反映树豆酮酸A对重组PTP1B蛋白活性作用的影响。 过表达PTP1B细胞的建立:采用脂质体（Lipofectamine2000）将携带ptp1b基因的表达载体(pCMV-PTPN1)转染HepG2细胞，建立ptp1b基因稳定过表达的HepG2/PTP1B细胞。实时荧光定量RT-PCR法检测ptp1b的mRNA水平，葡萄糖氧化酶法检测HepG2/PTP1B细胞对胰岛素刺激的敏感性。 树豆酮酸A对HepG2/PTP1B细胞胰岛素敏感性的作用:树豆酮酸A分高、中、低（25、12.5和6.25μmol/L）三个浓度，以罗格列酮(ROS)为阳性对照，ROS分组高、中、低三个浓度组（30、20和10μmol/L），分别作用HepG2/PTP1B细胞24h和48h，并添加胰岛素(10 nmol/L)刺激，葡萄糖氧化酶法检测树豆酮酸A对HepG2/PTP1B细胞胰岛素敏感性的改善作用。 树豆酮酸A对HepG2/PTP1B细胞胰岛素信号传导通路的作用:树豆酮酸A分高、中、低（25、12.5和6.25μ mol/L）三个浓度分别作用HepG2/PTP1B细胞24h，胰岛素刺激30min后提取总RNA，实时荧光定量RT-PCR法检测胰岛素信号传导通路中ptp1b、胰岛素受体底物-1（irs-1）、胰岛素受体底物-2（irs-2）、糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，有负向调节作用)以及葡萄糖转运体1，(glut-1）基因的mRNA水平。树豆酮酸A同样方式作用细胞，提取总蛋白，蛋白印迹(Western Blot)法检测PTP1B与GLUT-1蛋白表达水平以及IRS-1和磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)的酪氨酸磷酸化水平 实验结果:体外活性检测发现树豆酮酸A对纯化重组PTP1B活性具有抑制作用，半数抑制浓度IC50为63.19μ mol/L，其中在200μmol/L树豆酮酸A作用下，PTP1B的活性仅为空白对照的1.8％。 PTP1B表达载体转染HepG2后经过潮霉素筛选得到PTP1B稳定过表达的细胞系HepG2/PTP1B。实时荧光定量RT-PCR结果显示:与HepG2细胞比较， HepG2/PTP1B细胞的ptp1b mRNA水平提高4倍。葡萄糖消耗实验显示:在不同浓度的胰岛素(1、10、100 nmol/L)刺激下，HepG2细胞对葡萄糖的消耗明显增多，而HepG2/PTP1B细胞对葡萄糖的消耗则没有明显改变，表明PTP1B过度表达使细胞对胰岛素敏感性显著降低，形成胰岛素抵抗。 不同浓度树豆酮酸A分别作用HepG2/PTP1B细胞使其胰岛素敏感性明显增强。与不加药细胞对照，树豆酮酸A高、中、低剂量组作用24h和48h后，HepG2/PTP1B细胞葡萄糖消耗量分别提高154.3％、127.5％、58.8％和92.1％、53.7％、28.1％;而ROS高、中、低剂量组在24h和48h作用后，HepG2/PTP1B细胞糖消耗量分别提高224.2％，213.7％，168.4％和112.3％，104.3％，98.4％。表明树豆酮酸A可有效逆转细胞由于PTP1B过度表达而引起的胰岛素抵抗。 实时荧光定量RT-PCR结果显示:胰岛素信号通路基因irs-1和glut-1在HepG2和HepG2/PTP1B两种细胞内的表达模式存在明显差异。与无胰岛素刺激组比较，胰岛素作用后，HepG2细胞irs-1和glut-1 mRNA水平分别提高1倍和2倍;而在HepG2/PTP1B细胞中glut-1 mRNA水平无明显变化，irs-1转录水平反而下降约60％。这在基因水平印证了高水平PTP1B对胰岛素促进的基因表达有负向调节作用。 树豆酮酸A作用可提高HepG2/PTP1B细胞内胰岛素刺激的irs-1、irs-2、 gsk3β和glut-1基因的表达水平。高剂量浓度(25μmol/L)作用下irs-1、irs-2、 gsk3β和glut-1基因mRNA水平分别为原来的5.0、2.0、1.5和2.6倍。实验结果表明树豆酮酸A对胰岛素信号传导相关基因表达有正向调节作用。 树豆酮酸A对ptp1b mRNA水平无显著影响，但Western Blot结果显示可下调PTP1B蛋白水平，提示树豆酮酸A对PTP1B表达的抑制作用可能主要为转录后调控。 Western Blot结果显示:与HepG2细胞比较，HepG2/PTP1B细胞中由于PTP1B表达上调，胰岛素刺激的IRS-1(pY612)和PI3K(pY607)蛋白的磷酸化水平及GLUT-1蛋白的表达水平明显下降。伴随树豆酮酸A对PTP1B蛋白水平的下调作用，胰岛素刺激的IRS-1(pY612)和PI3K(pY607)蛋白的磷酸化水平得到提高，GLUT-1蛋白的表达水平也呈上升状态。 结论:PTP1B作为胰岛素信号传导通路的负性调节因子，其过度表达显著降低HepG2细胞对胰岛素的敏感性。树豆酮酸A可通过抑制PTP1B活性、下调PTP1B蛋白表达，从而提高胰岛素信号传导通路部分相关蛋白磷酸化水平及表达水平，激活胰岛素信号传导通路，有效逆转细胞由于PTP1B过度表达而引起的胰岛素抵抗。
树豆酮酸;糖尿病;胰岛素抵抗;信号传导通路;病理特征
广州中医药大学
硕士
中医临床基础
杨瑞仪
2015
中文
R255.4
61
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）