小柴胡汤及其寒热减方抗血清及其蛋白氧化作用的研究
目的：观察肝细胞癌（以下简称HCC）、2型糖尿病（以下简称T2DM）患者血清及血清中脂蛋白、白蛋白的氧化改变，初步探讨小柴胡汤及其寒热减方对血清及血清脂蛋白、白蛋白的抗氧化作用。 方法：⑴按《新编常见恶性肿瘤诊治规范·原发性肝癌》的临床诊断标准选取原发性肝癌实验对象，2型糖尿病诊断标准选取2型糖尿病实验对象，及正常体检者。⑵分组、氧化:将肝细胞癌患者血清、2型糖尿病患者血清、正常体检者血清分别在标号为1～7号的1.5ml塑料管中分别注入150ul血清，再按按以下要求添加试剂：空白管:150ul血清+12ulPBS；对照管:150ul血清+6ulCuSO4+6ulPBS；小柴胡汤管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡汤药液；小柴胡汤去柴胡药液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡汤去柴胡药液；小柴胡汤去黄芩药液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡汤去黄芩药液；小柴胡汤去半夏药液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡汤去半夏药液；小柴胡汤去干姜药液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡汤去干姜药液。上述溶液混匀后，4℃下静置24小时，然后进行一下步骤。⑶测量血清CD、ONOO-、MDA:在紫外分光光度计中，测量方法2血清中0D234、0D280、0D302及0D535。⑷分离脂蛋白、白蛋白:分别吸取方法2中血清50ul，加入EDTA10ul，4℃条件下静置24h，然后加入PBS10ul，4℃条件下再静置24h，分别加入苏丹黑B溶液染料5ul预染血清，42℃水浴30min，静置一小时后分别吸取预染血清25ul点样，电泳45min，具体步骤如下:量取0.5％琼脂糖凝胶32ml加热融化，于42℃水浴箱中冷却，倒入10cm×7.8cm电泳U型槽，插入配套七齿塑料小凳，等待10min，待凝胶冷却凝固后除去小凳;按方法2所分(1)-(7)组由左向右分别注入预染血清25ul;将点样样品端置于电泳槽，以电压132V设置电泳仪，电泳时间45分钟，分离脂蛋白。将染液换为考马斯亮蓝溶液，同法分离白蛋白。⑸检测脂蛋白CD、ONOO-、MDA:将上述方法4电泳后所得凝胶中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白条带分别切出，分别用4ml90％乙醇在4℃环境下浸泡24h，而后吸取1ml浸出上清液，在紫外分光光度计中测量0D234、0D280、0D302及0D535。⑹检测白蛋白CD、ONOO、巯基:将上述方法4电泳后所得凝胶板中的白蛋白条带切出，分别用4ml90％乙醇在4℃环境下浸泡24h，而后吸取1ml浸出上清液按方法7测量巯基，剩余3ml浸出液分别测量CD、ONOO，记录数据。⑺测血清巯基SH:吸取方法2中血清0.1ml，加蒸馏水1ml、6M KI溶液1ml、5％淀粉溶液3滴、PH7.6磷酸缓冲液3.9ml（至总容量为6ml）。混匀后置光径20mm比色杯内。然后向比色杯加0.3ml的0.001N碘液。小心混匀，在加入碘液10秒钟后比色，使用500nm滤光片，以空气调零，测500nm波长的光密度。⑻紫外光谱分析血清-药物相互作用吸取方法2中血清15ul，加入2850ul蒸馏水，4℃环境静置4小时后，取上清液置于石英比色杯中，以空气调零点，在紫外分光光度计中测190～400nm范围，以10nm为间隔的光密度值。 结果：①三组血清中，各组对照管CD值皆略高于组内空白管CD值，但无统计学意义;HCC组中小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管CD值对比对照管CD值降低，其中小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管CD值对比对照管CD值降低，有明显统计意义，小柴胡汤去黄芩药液管CD值对比对照管CD值降低，有统计意义;正常组及T2DM组中，小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管CD值对比对照管CD值降低，有明显统计意义，小柴胡汤去黄芩药液管CD值对比对照管CD值降低，无统计意义。②三组血清中，各组空白管ONOO值对比组内对照管ONOO值高，对比具有明显统计意义。HCC组中小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有降低，无统计意义，小柴胡汤去黄芩药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有升高，无统计意义;正常组中，小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有降低，无统计意义，小柴胡汤管、小柴胡汤去黄芩药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有升高，无统计意义;T2DM组中，小柴胡汤、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有升高，无统计意义，小柴胡汤去柴胡汤药液管ONOO值对比对照管ONOO值略有降低，无统计意义。③三组血清中，各组空白管MDA值对比组内对照管MDA值高，对比具有明显差异;各组中小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管MDA值对比组内对照管MDA值皆有降低，皆有明显统计意义，其中，三组中小柴胡汤去柴胡药液管均为各实验组中MDA值最高的。④HCC组高密度脂蛋白空白管CD值低于对照管，对比有明显统计意义，T2DM组高密度脂蛋白小柴胡汤去柴胡药液管CD值低于对照管，对比有统计意义;HCC组低密度脂蛋白空白管CD值低于对照管，对比有明显统计意义，正常组低密度脂蛋白空白管CD值低于对照管，对比有统计意义;HCC组低密度脂蛋白小柴胡汤去半夏药液管ONOO值低于对照管，对比有统计意义，正常组低密度脂蛋白小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管ONOO值低于对照管，对比有统计意义，T2DM组低密度脂蛋白小柴胡汤去柴胡药液管ONOO值低于对照管，对比有统计意义;T2DM组高密度脂蛋白小柴胡汤管、小柴胡汤去干姜药液管MDA值低于对照管，对比有统计意义，正常组低密度脂蛋白小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去干姜药液管MDA值低于对照管，对比有统计意义。⑤正常组、T2DM组对照管SH值皆高于空白管，升高值有明显统计意义。HCC组中，对照管SH值略低于空白管SH值，降低值有明显统计意义，小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管SH值皆高于对照管SH值，差异具有明显统计意义;正常组中，小柴胡汤管、小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去黄芩药液管、小柴胡汤去半夏药液管、小柴胡汤去干姜药液管SH值皆低于对照管SH值，其中小柴胡汤去柴胡药液管SH值较对照管SH值降低具有统计意义，其余管SH值较对照管降低值均具有明显统计意义;T2DM组中，小柴胡汤管、小柴胡汤去干姜药液管SH值较对照管SH值有所升高，升高值具有明显统计意义，小柴胡汤去半夏药液管SH值较对照管SH值升高，升高值有统计意义，小柴胡汤去柴胡药液管、小柴胡汤去干姜药液管SH值较对照管SH值略有降低，降低值具有明显统计意义。 结论：⑴小柴胡汤作为中医学中和解少阳的代表方剂，被广泛用于临床多种疾病，现代药理研究也发现了其抗氧化功效，本实验研究发现:小柴胡汤及其寒热减方对HCC患者血清、T2DM患者血清、正常人血清有抗氧化作用，对T2DM患者血清、正常人血清的抗氧化作用明显。⑵小柴胡汤对T2DM患者血清高密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡汤去柴胡药液对T2DM患者血清高密度脂蛋白及低密度脂蛋白有抗氧化作用，对正常人血清低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡汤去黄芩药液对正常人低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡汤去半夏药液对HCC患者血清低密度脂蛋白、正常人低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡汤去干姜药液对T2DM患者血清高密度脂蛋白、正常人血清高密度脂蛋白及低密度脂蛋白有抗氧化作用。⑶小柴胡汤对T2DM患者血清白蛋白有抗氧化作用;小柴胡汤去干姜药液对T2DM患者血清白蛋白有抗氧化作用。
肝脏肿瘤;中药治疗;小柴胡汤;药理分析
广州中医药大学
硕士
中西医结合基础
刘晓秋
2015
中文
R735.7;R730.52
81
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）