参环毛蚓肌细胞原代培养与鉴定研究
目的: 鉴于参环毛蚓来源的广地龙药材的主要药用部位为除去内脏的体壁肌肉组织，本研究试图建立参环毛蚓肌细胞原代培养体系，以期获得数量多、一致性高、遗传物质稳定的无菌细胞群体。为参环毛蚓肌细胞系的建立奠定基础，进一步为实现在细胞和分子水平上进行的后续研究提供载体，同时为无脊椎动物中的类似动物细胞培养提供可借鉴的技术方法。 方法: 1.参环毛蚓样品的采集与鉴定在参环毛蚓的主要分布地，野外随机采集活体，进行物种来源鉴定。选取体型健壮，生殖环带明显，活力较强，平均湿重约5～8g／条的健康蚯蚓。 2.参环毛蚓肌肉组织解离方法的筛选通过比较组织贴块法和酶消化法对参环毛蚓肌肉组织的解离情况，筛选一种能够获得数量多，活性好的肌细胞的解离方法。通过两因素完全随机设计实验方法，筛选最佳酶解条件，采用血细胞计数法及CCK-8法进行评价，所得数据均按照统计学方法处理。 3.参环毛蚓肌细胞培养条件的筛选及优化根据预实验选择影响肌细胞培养的关键因素，通过考察参环毛蚓肌细胞培养的细胞接种密度、血清浓度、基础培养基种类、细胞生长因子等条件对其离体培养的影响，对其体外培养条件进行优化，筛选出最合适的细胞生长条件,并通过绘制生长曲线及CCK-8检测细胞活性进行比较和评价。所得数据均按照统计学方法处理。 4.参环毛蚓肌细胞的鉴定利用透射电镜观察组织形态，依据类似组织细胞形态对参环毛蚓肌肉组织及培养的肌细胞进行超微结构比较鉴定，以证明该细胞来源的真实性。 结果: 1.经鉴定，本研究野外采集到的品种均为巨蚓科环毛蚓属参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)。 2.经台盼蓝染色法及CCK-8活性测定，筛选出适合参环毛蚓肌肉组织最佳的解离方法—酶消化法。其中，酶种类为Ⅰ型胶原酶，酶浓度为1mg/mL，酶解时间为24 h。该条件获得的细胞数量较多，细胞活性最好。 3.经细胞计数、CCK-8细胞活性检测及细胞培养状态显示，参环毛蚓肌细胞最适宜的接种浓度为:2×105个/mL;培养时以Grace's Insect Cell Culture Medium（简称Grace's培养基）为基础培养基，添加的血清浓度为15％较为合适;添加细胞生长因子EGF浓度为0.1ng/mL时对细胞生长有利，在铺有MG作为基质培养的肌细胞活性较好。 4.经透射电镜鉴定，参环毛蚓的肌肉组织超微结构显示:肌细胞核显长梭形，分布在肌细胞的边缘或近末端，肌细胞的细胞质以线粒体和肌浆网小泡为主，较少出现其他细胞器，并且肌细胞类型有环肌细胞和纵肌细胞两类。细胞超微结构显示体外培养的参环毛蚓肌细胞与肌肉组织拥有相同的结构特点，据此证明该细胞来源于参环毛蚓肌肉组织。 结论: 本研究建立了一套参环毛蚓肌细胞原代培养方法，并对其来源进行了鉴定，获得了数量多、活性较好的无菌细胞群体。细胞增值缓慢，能存活30天以上。该成果对肌细胞系的建立具有重要意义，因细胞系的建立不仅为今后广地龙药效活性物质的基因功能组分分析、基因表达调控机制以及代谢活动规律等的相关研究提供必要的载体;也为实验室进行大规模和长时间的实验研究提供样本，一定程度上可避免实验材料来源的困难，缓解参环毛蚓野生资源锐减的现状。此外关于肌细胞增值及细胞系建立的研究还有待进一步的探索和实践。
地龙药材;参环毛蚓;肌细胞;原代培养;物种鉴定
广州中医药大学
硕士
中药学
李薇
2015
中文
R284.1;R282.74
80
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）