隔山香正丁醇部位对大鼠胸主动脉的舒张作用及其机制研究
目的: 草药隔山香(Ostericum citriodorum(Hance) Yuan et Shan)是我国的特有植物，具有行气止痛、活血散瘀的功效，临床上多应用于治疗因平滑肌痉挛而引起的心绞痛、胃痛以及腹痛等疾病，但其相关药效物质基础及作用机制并不清晰。本课题组前期研究发现隔山香低级性部位—石油醚部位及其代表性活性成分—异芹菜脑对含内皮离体大鼠胸主动脉血管环均有舒张作用，并且异芹菜脑对血管的舒张作用呈现内皮依赖性。本课题延续前期研究，进一步考察隔山香高极性部位对大鼠胸主动脉环的舒张作用及其机制研究，开展了隔山香正丁醇部位对离体大鼠胸主动脉血管环张力的影响实验，考察了对血管平滑肌细胞钙离子浓度的影响;对正丁醇部位进行化学成分的分离和药效活性研究;对正丁醇部位再以大孔吸附树脂粗分部位考察活性。从器官到细胞水平上探讨了隔山香高极性部位对血管舒张的影响及可能的作用机制，丰富了隔山香“行气止痛”的科学内涵。 方法: 1、隔山香正丁醇部位对离体大鼠胸主动脉血管环张力的影响及其机制研究。采用离体大鼠胸主动脉血管环的实验模型，考察隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)对氯化钾(KCl)和去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环张力的影响;在无Ca2+Kreb's液中，考察隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)对氯化钙和去甲肾上腺素(NE)预收缩的去除内皮血管环张力的影响。 2、隔山香正丁醇部位对血管平滑肌细胞内钙浓度的影响。预先用钙荧光探针Fluo-3/AM负载VSMC，应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)实时测定胞质内[Ca2+]i的变化。在Hank's液（钙浓度为2.0mmol/L）中，考察隔山香正丁醇部位(0.65mg/mL)对氯化钾(KCl)诱导胞质内钙离子浓度升高的影响;在D-Hank's液(钙浓度为0mmol/L)中，考察隔山香正丁醇部位(0.65mg/mL)对去甲肾上腺素(NE)、毒胡萝卜素(TG)诱导胞质内钙离子浓度升高的影响。 3、隔山香正丁醇部位分离纯化的单体成分对对离体大鼠胸主动脉血管环张力的影响。采用植化分离法对正丁醇部位进行分离纯化，并采用离体大鼠胸主动脉血管环的实验模型，考察分离纯化的单体成分对去甲肾上腺素(NE)和氯化钾(KCl)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环张力的影响。 4、隔山香正丁醇部位再以大孔吸附树脂粗分部位对离体大鼠胸主动脉血管环张力的影响。采用离体大鼠胸主动脉血管环的实验模型，考察隔山香正丁醇部位过大孔吸附树脂后的水洗液、30％醇洗液、60％醇洗液、95％醇洗液对去甲肾上腺素(NE)和氯化钾(KCl)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环张力的影响。 结果: 1、隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)对氯化钾(KCl)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均具有浓度依赖性的舒张作用，并且去除内皮后的舒张作用未受影响;隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)对去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环也有浓度依赖性的舒张作用，并且去除内皮后的舒张作用未受影响。去除内皮的血管环在无Ca2+高钾条件下，当浴槽溶液中钙离子浓度逐渐增加后（最大浓度为3.0mmol/L），血管环会随着钙离子浓度的增加进一步收缩，但与空白组相比，隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)都能引起收缩强度显著性降低。去除内皮的血管环在无Ca2+条件下，隔山香正丁醇部位(0.34、0.65、1.22mg/mL)能够引起无钙溶液中去甲肾上腺素(NE)诱导的血管收缩幅度显著降低。 2、在静息状态下，与空白组相比较，隔山香正丁醇部位(0.65mg/mL)对VSMC胞质内的[Ca2+]i无明显影响[(1.06±0.09)vs.(1.07±0.14)，P＞0.05];隔山香正丁醇部位(0.65mg/mL)对氯化钾(KCl)、去甲肾上腺素(NE)、毒胡萝卜素(TG)诱导的VSMC胞质内的[Ca2+]i升高均有明显的抑制作用[(3.76±1.58) vs.(1.76±0.28);(4.53±1.57)vs.(0.89±0.13);(4.48±0.83)vs.(1.66±0.46),P＜0.01],且其抑制率分别为(48.18±15.12)％、(49.67±16.57)％、(52.90±9.57)％。 3、正丁醇部位中分离两个化合物（暂定为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ），化合物Ⅰ、化合物Ⅱ对氯化钾(KCl)和去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均无舒张作用。 4、隔山香正丁醇部位过大孔吸附树脂后的水洗液、30％醇洗液、60％醇洗液对氯化钾(KCl)和去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均无舒张作用;隔山香正丁醇部位过大孔吸附树脂后的95％醇洗液对氯化钾(KCl)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均具有一定的舒张作用，并且去除内皮后的舒张作用未受影响;隔山香正丁醇部位过大孔吸附树脂后的95％醇洗液对去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均具有一定的舒张作用，并且去除内皮后的舒张作用未受影响。 结论: 1、隔山香正丁醇部位对血管呈现非内皮依赖性的舒张作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，可能通过阻断电压依赖性钙通道(VDCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)，进一步抑制细胞内IP3敏感Ca2+通道的开放，抑制外钙内流、内钙释放，降低细胞内钙浓度，从而舒张血管。 2、隔山香正丁醇部位可以抑制氯化钾(KCl)、去甲肾上腺素(NE)、毒胡萝卜素(TG)诱导的血管平滑肌细胞内钙的升高，其可能机制是:1、通过阻断细胞膜上的电压依赖性钙通道(VDCC);2、通过阻断肌浆网网膜上的IP3敏感Ca2+通道降低内质网Ca+释放，并且抑制细胞膜上的受体操纵性钙通道(ROCC);3、通过激活肌浆网Ca2+-ATPase，拮抗钙库耗竭，并且拮抗钙库操纵性钙通道(SOCC)。 3、隔山香正丁醇部位分离的化合物Ⅰ、化合物Ⅱ对血管无舒张作用，提示其不是正丁醇部位舒张血管的代表性成分。 4、隔山香正丁醇部位过大孔吸附树脂后的水洗液、30％醇洗液、60％醇洗液对血管无舒张作用，95％醇洗液对血管的舒张作用呈现非内皮依赖性，提示可从95％醇洗液进行纯化分离，获得代表隔山香正丁醇部位非内皮依赖性舒张血管作用的活性成分。
隔山香;正丁醇部位;胸主动脉;血管环;平滑肌细胞;舒张作用
广州中医药大学
硕士
中药学
陈建南
2015
中文
R284.1;R543.105
96
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）