6α-hydroxy-lup-20(29)-en-3-on-28-oic acid对前脂肪细胞成脂分化和胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗的影响
2型糖尿病(Type2 diabetes Mellitus，T2DM)主要是因机体产生胰岛素抵抗而造成葡萄糖(Glucose，GLU)吸收障碍为特征的代谢性综合征，是目前严重危害人类健康的一种常见病和多发病。目前尚无特效的根治糖尿病药物，因此研究和开发新的用于糖尿病治疗药物十分必要。 背景与目的: 本课题组前期研究发现，从珊瑚树(Viburnum odoratissimum)中获得的羽扇豆烷型三萜6α-hydroxy-lup-20(29)-en-3-on-28-oic acid(B21)能显著促进人肝癌细胞和小鼠脂肪细胞的葡萄糖消耗，显示了良好的胰岛素增敏作用。为了探讨B21作为开发糖尿病治疗药物先导化合物的可能性，本研究利用人内脏来源的前成脂肪细胞(Human White Preadipocytes-visceral，HWP-visceral)、小鼠前脂肪细胞(3T3-L1preadipocytes)和小鼠成肌细胞(C2C12 myblasts)为模型，对B21抑制脂肪细胞分化、增强胰岛素敏感性的作用和机制进行了深入的研究。 方法: 1.文献研究 检索糖尿病发生发展的最新相关机制、治疗状况及治疗糖尿病药物的新动态，并对其进行归纳总结。 2.实验研究 2.1 B21对前脂肪细胞增殖和分化的影响 2.1.1 将B21作用于对数生长期的3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral细胞48h，CCK-8法检测不同浓度B21作用下的细胞活力，评价其对细胞增殖的影响。 2.1.2 3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral细胞在进行脂肪分化诱导的同时加入不同浓度B21，分化诱导持续8d。采用油红O染色分化完成的脂肪细胞;采用甘油三酯(TG)定量检测试剂盒检测细胞内TG含量。评价B21对脂肪细胞分化和甘油三酯合成的影响。 2.2 B21对脂肪细胞和肌细胞胰岛素抵抗的影响:在3T3-L1 adipocytes、人脂肪细胞Human White Adipocytes-visceral，HWA-visceral以及小鼠肌细胞(C2C12myocytes模型上，采用1μ M的地塞米松(Dexamethason，DXM)诱导细胞出现胰岛素抵抗，同时将不同浓度B21作用于细胞48h，收集细胞培养液，GLU氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD法)检测GLU浓度，测定细胞对GLU的消耗，评价B21对细胞胰岛素敏感性的作用。 2.3 B21抑制脂肪细胞分化、逆转脂肪细胞胰岛素抗性的机制研究 2.3.1 3T3-L1 preadipocytes在不同浓度B21存在下进行脂肪细胞分化诱导8d。实时荧光定量RT-PCR法测定PPARγ和C/EBPα的mRNA水平;提取总蛋白，ELISA法测定脂肪酸合成酶FAS的含量。分析B21对脂肪细胞分化过程中的关键转录因子PPARγ和C/EBPα基因的表达、以及对FAS表达的影响。 2.3.2 不同浓度的B21与1μM的DXM共同作用于3T3-L1脂肪细胞48h。RT-PCR法测定细胞内PTP1B的mRNA水平，分析B21对DXM诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞中PTP1B基因过表达的影响。 2.3.3 不同浓度的B21与1μM的DXM共同作用于3T3-L1脂肪细胞48h。收集培养基上清液，ELISA法侧定TNF-α、IL-6、瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)的浓度，分析B21对DXM诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞中不正常的细胞因子释放的调节作用。 2.3.4 不同浓度的B21与1μ M的DXM共同作用于3T3-L1脂肪细胞48h。收集细胞提取总蛋白，Western bLotting法检测GLUT4，AKT，IR-α，PI-3K和IRS1蛋白的表达，分析B21对胰岛素抵抗脂肪细胞中胰岛素信号通路关键蛋白表达的影响。 结果： 1. 活性 1.1 B21在20μ M浓度下作用于3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral细胞48h，不影响细胞的活力和增殖（P＞0.05）。 1.2 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化诱导过程中加入不同浓度的B21，能剂量依赖地降低3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral细胞的成脂分化能力，使油红O对细胞的染色程度降低。 1.3 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化诱导过程中加入不同浓度的B21，可剂量依赖地降低细胞利用葡糖糖转化合成FFA的能力，从而减少细胞内TG的合成和积累。 1.4 在DXM诱导的胰岛素抵抗小鼠脂肪细胞、人脂肪细胞和小鼠肌管细胞模型上，B21能剂量依赖地促进细胞对培养液中GLU的利用，增加糖消耗，增强细胞的胰岛素敏感性。 2.机理 2.1 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化诱导过程中加入不同浓度的B21，能不同程度地抑制脂肪细胞中脂肪合成酶FAS的表达，并显著下调细胞内PPARγ和C/EBPα的mRNA水平(P＜0.01)。 2.2 在DXM诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型上，B21作用48h能显著抑制下调细胞内PTP1B的mRNA水平（P＜0.05)，刺激胰岛素信号通路关键蛋白GLUT4、AKT、IRα、IRS1等的表达，抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-6和Leptin的分泌（P值均小于0.05），促进抗炎细胞因子Adiponectin的分泌（P＜0.05)。 结论与创新： 1.我们的研究发现，6α-hydroxy-l up-20(29)-en-3-on-28-oic acid在不影响细胞增殖和活力的浓度下能显著抑制小鼠前脂肪细胞和人前脂肪细胞的分化，并能显著增强DXM致胰岛素抵抗的小鼠脂肪细胞、人脂肪细胞和小鼠肌管细胞对GLU的吸收，是—种具有抑制脂肪分化和脂肪生成作用的胰岛素增敏剂。其抑制脂肪分化和生成的作用是通过下调转录因子PPARγ和C/EBPα的基因表达来完成的;而其增强胰岛素敏感性的作用则主要是通过下调PTP1B基因表达、增强胰岛素信号通路蛋白表达、抑制炎症因子分泌、刺激抗炎因子的释放来完成的。 2.6α-hydroxy-lup-20(29)-en-3-on-28-oic acid具有作为调脂降糖药物开发的先导化合物的潜质。
珊瑚树;羽扇豆烷型三萜;前脂肪细胞;脂肪分化;胰岛素信号通路;胰岛素敏感性
广州中医药大学
硕士
中药学
胡英杰
2015
中文
R284.1;R977.15
92
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）