小儿心脏手术中输血致血小板变化的临床研究及围体外循环期无血浆预充策略的探讨
研究总体思路: 众所周知，输血可引起一系列不良反应并且影响患者的预后，但目前输血引起相关不良反应的具体机制尚未完全阐明。血小板作为血液三大组分之一，有关输血对其影响的研究目前甚少。先天性心脏病患儿是目前临床用血的一大群体。紫绀型先心病患儿体外循环(CPB)预充液中常常加入血浆(FFP)，但FFP预充能否改善术后凝血功能尚不明确。为了加强临床合理使用血液制品的意识以及制定有效的血液保护策略，进一步研究输血引起相关缺血性并发症的机制以及探讨安全合理的节约用血策略成为本课题的研究重点。本研究拟分为以下两大部分: 第一部分拟探讨输血引起先天性心脏病患儿血小板相关不良反应的机制。主要研究输血对血小板活性及功能的影响，并且检测血浆中血小板来源的几种microRNAs的水平，观察其能否作为血小板激活的指标。研究分为两个阶段:第一阶段在离体状态下将患儿新鲜全血与贮存红细胞悬液混合模拟体内输血过程，研究输血单因素对先天性心脏病患儿血小板活性及功能的影响。通过检测输血组及未输血组患儿血小板活性及功能相关的指标，一方面阐明输血能否提高血小板反应性，促进其激活和聚集，有利于进一步明确输血导致相关缺血性并发症的机制，另一方面评价血小板microRNAs能否作为血小板激活的指标，用于评价不同疾病中血小板的活性状态。第二阶段在在体水平上观察先天性心脏病患儿体外循环中输血对术后血小板活性及功能的影响。CPB中多种因素均会引起一定程度的血小板激活，对术后凝血功能维护产生不利影响。因此，此阶段拟综合考虑体外循环和输血双重因素对患儿术后血小板活性及功能的影响，以明确体外循环中输血是否进一步加剧血小板的激活以及术后凝血系统功能的紊乱，有利于加强临床合理用血意识。 第二部分拟探讨先天性心脏病患儿围体外循环期节约血制品的策略。主要观察体外循环中实施无血浆预充策略对紫绀型先天性心脏病患儿术后凝血功能及临床状况的影响。根据预充胶体液的种类，将入选的紫绀型先天性心脏病患儿随机分为两组:佳乐施预充组及血浆预充组。采用血栓弹力图(TEG)检测两组患儿术前、术后的凝血功能，并比较两组患儿术后出血量、血液制品的使用情况以及恢复时间，旨在评价人工胶体佳乐施替代血浆用于紫绀型先天性心脏病患儿体外循环管路预充的安全性和有效性。为进一步寻找体外循环中理想的血浆替代品、完善临床血浆应用规范及应对血液紧张的状况起到积极推动作用。 第一部分第一阶段离体状态下研究血小板microRNAs在先天性心脏病患儿输血导致血小板激活中的作用 研究目的: 本研究拟通过检测血浆中的几种血小板microRNAs来观察离体状态下输血对先天性心脏病患儿血小板活性和功能的影响，并评价血小板microRNAs能否作为血小板激活的指标。旨在一方面为阐明输血导致先天性心脏病患儿相关缺血性并发症的潜在机制提供参考，有利于加强临床合理用血的意识，促进临床规范用血。另一方面为临床评价各种疾病状态下血小板的活性提供新的指标。 研究方法: 2013年10月至2014年06月，选择本院100例拟行先天性心脏病矫治术的患儿作为研究对象，随机分为输血组和未输血组，每组各50例。患儿入室麻醉后，经颈内静脉置管抽取静脉血3.6 ml分别注入两只枸橼酸抗凝管内，每管各含1.8 ml。输血组两管血标本中各加入0.5 ml同型的贮存红细胞悬液，轻轻混匀，30 min后进行相应指标检测。未输血组两管血标本不予处理，室温静置30 min后进行相应指标检测。采用流式细胞仪检测20μM ADP诱导前后两组患儿P-选择素以及血小板微粒(PMPs)的表达水平。比较两组患儿ADP诱导前后ΔP-选择素和ΔPMPs的水平。光密度比浊法检测两组患儿ADP诱导下血小板60s、180s、300s的聚集度、最大聚集度和达到最大聚集度的时间。运用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测血浆血小板来源的miR-223、miR-24、miR-126、miR-191的水平。进一步比较未输血组患儿中，非紫绀型亚组与紫绀型亚组间血小板活性、聚集功能及上述几种microRNAs的表达有无差异。 研究结果: 两组患儿输血前血红蛋白(Hb)水平无组间差异(P＞0.05)，输血组加入0.5 ml贮存红细胞悬液后，Hb较之前升高23±6g/L。两组患儿静息状态下血小板表面P-选择素的表达以及PMPs的水平无明显差异。但经20μM ADP作用后，输血组血小板表面ΔP-选择素的表达水平以及ΔPMPs的含量均较未输血组明显增加(P＜0.05)。与未输血组相比，输血组患儿血小板180s、300s聚集率及最大聚集率明显增高（P＜0.05），血浆血小板来源的几种microRNAs含量也明显升高(P＜0.05)，且以miR-223的差异性最为显著。未输血组中，紫绀型亚组血小板激活程度较非紫绀型亚组明显增高，血小板聚集功能明显降低，几种microRNAs的表达均较高(P＜0.05)。 研究结论: 输血可提高先天性心脏病患儿血小板反应性，促进血小板激活和聚集，可能是输血引起此类患儿相关缺血性并发症的潜在机制。血浆中的血小板microRNAs，尤其是miR-223，可作为血小板激活的指标用以研究不同疾病状况下血小板的活性状态。不同类型的先心病患儿血小板的激活程度不同，血浆血小板microRNAs的水平不同。为减少输血相关不良反应，临床输血应严格掌握用血指征。 第一部分第二阶段血小板microRNAs在先天性心脏病患儿体外循环中输血导致的血小板激活作用研究 研究目的: 体外循环(CPB)中肝素抗凝作用的不充分以及人工材料表面接触等多种因素均会引起一定程度的血小板激活，使得血小板过度消耗，不利于维持术后的凝血功能。先天性心脏病患儿CPB过程中常常需要输血以维持一定的血细胞压积(HCT)，保证组织供氧。因此，本阶段的研究拟在第一阶段阐明输血单因素对血小板活性和功能影响的基础上，进一步在在体水平上观察体外循环和输血双重因素对患儿术后凝血功能的影响，旨在明确体外循环中输血是否加剧血小板的激活以及凝血功能的紊乱，进一步强化临床合理使用血液制品的意识。并且本研究基于国内最大的先天性心脏病诊疗中心的平台，旨在对已有的改良节约用血策略的安全性和有效性进行进一步评估，为今后在全国范围内推广以及指定适合中国国情的输血指南起到积极的推动作用。 研究方法: 选择本院2014年06月至2015年01月在改良节约用血体外循环策略下行择期手术的先天性心脏病患儿，根据CPB过程中有无输血指征进行输血或免输血，根据有无输血将患儿分为输血组和未输血组，每组各收集40例。患儿入室麻醉后及鱼精蛋白中和后20 min两个时间点，经颈内静脉置管抽取静脉血3.6 ml分别注入两只枸橼酸抗凝管内，每管各含1.8 ml。采用流式细胞仪检测两组患儿血小板表面P-选择素的表达以及血小板微粒(PMPs)的水平。光密度比浊法检测两组患儿ADP诱导下血小板60s、180s、300s的聚集度、最大聚集度和达到最大聚集度的时间。运用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测血浆血小板来源的miR-223、miR-24、miR-126、miR-191的水平。收集两组患儿术前一般资料、术中的重要监测指标以及术后出血、血液制品使用量和恢复时间等相关指标。 研究结果: 两组患儿的身高、年龄、体重及术前HCT值存在明显的统计学差异(P＜0.05)，其他一般资料无组间差异(P＞0.05)。两组患儿术前P-选择素及PMPs的水平无明显组间差异（P＞0.05）。两组患儿术后P-选择素的表达组间比较也无统计学差异(P＞0.05)，但与未输血组相比，输血组术后PMPs的含量明显升高(P＜0.05)。两组患儿术前血浆四种microRNAs的水平无组间差异(P＞0.05)。与未输血组相比，输血组术后血浆四种microRNAs的水平明显增高（P＜0.05）。两组患儿术后60s、180s和300s的血小板聚集度以及最大聚集度均较各组术前明显降低(P＜0.05)。两组患儿术前血小板聚集功能各参数组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。与未输血组相比，输血组术后180s、300s和最大聚集度明显降低(P＜0.05)。两组患儿术后肝肾功能无差异（P＞0.05）。与未输血组相比，输血组患儿术后各时点出血量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。输血组ICU红细胞输注明显高于未输血组，而血小板、血浆及凝血制剂的使用量两组间无差异(P＞0.05)。术后机械通气时间、ICU停留时间及住院时间两组比较无明显差异(P＞0.05)。 研究结论: ①体外循环可引起先心病患儿血小板激活，导致术后血小板功能降低，表现为术后P-选择素的水平较术前明显增加，血小板聚集度明显降低，血浆四种血小板miRNAs的水平较术前明显增高。②输血可引起先心病患儿术后血小板激活增加以及血小板聚集功能的降低。③血浆中的血小板miRNAs相比于血小板表面P-选择素在某些方面更适合作为血小板激活状态的指标。④实施改良节约用血策略可明显减少术后的出血和输血量，且没有对患儿术后早期造成不利影响。 第二部分体外循环实施无血浆预充策略对紫绀型先天性心脏病患儿术后凝血及恢复状况的影响 研究目的: 紫绀型先天性心脏病患儿在体外循环(CPB)下行矫治术时，CPB预充液中常常预防性加入新鲜冰冻血浆(FFP)，旨在通过补充一定的凝血因子和纤维蛋白原，减轻术后凝血功能紊乱。紫绀型患儿被认为相比于非紫绀型患儿更有可能从FFP的预防性输注中获得益处。然而，不仅预防性输注FFP缺乏循证学依据，而且输注血制品还会引起一系列不良反应。因此，阐明FFP的预防性使用价值，循证应用FFP具有重要的临床意义。本研究拟观察FFP预充或人工胶体佳乐施预充对紫绀型患儿术后凝血功能及临床状况的影响，以阐明紫绀型患儿CPB中预防性使用血浆能否产生预期的临床效果，并且评价佳乐施能否安全有效的代替FFP用于紫绀型患儿CPB预充，为临床循证应用血浆提供新的依据，也为血液保护提供新的措施。 研究方法: 2013年02月至2013年10月，选取100例行先天性心脏病矫治术的紫绀型患儿纳入研究。患儿的年龄在6个月至三岁之间。将所选患儿随机分为两组:佳乐施预充组（Gelofusine，GEL组）和新鲜冰冻血浆预充组（FFP组），每组各50例患儿。GEL组CPB管路预充10～20 ml/kg佳乐施，FFP组CPB管路预充1～2 U新鲜冰冻血浆。两组患儿CPB管路均常规预充100～200 ml醋酸钠林格氏液。在麻醉诱导后和鱼精蛋白中和后15 min两个时间点取血检测快速TEG（r-TEG）相关指标及功能性纤维蛋白原(FLEV)的含量。记录术后肝肾功能，6h、24 h和总的胸液引流量，血液制品和凝血制剂的使用量，机械通气时间，ICU停留时间和术后住院时间。观察转后检测的TEG参数与术后出血量的关系。分析术前的一般资料和血液学参数与术后出血量的关系。 研究结果: 两组患儿术前一般资料无明显差异(P＞0.05)。两组患儿转后凝血功能均较各组转前明显降低，表现为R值明显增高，MA、MAf、FLEV明显降低(P＜0.05)。与GEL组相比，FFP组转后纤维蛋白原含量(MAf、FLEV)明显增高，但两组凝血因子水平(R)、血小板功能(MAp)及整体凝血功能(MA)均无明显差异。两组患儿术后出血量、血液制品和凝血制剂的使用量均无明显差异（P＞0.05）。两组患儿术后机械通气时间、ICU停留时间和术后住院时间也无统计学差异（P＞0.05）。鱼精蛋白中和后15 min检测的MA值与术后早期（6h时）的出血量呈中度负相关（r=-0.624，P＜0.001），与术后24 h出血量无明显相关性（r=-0.115，P=0.279）。简单线性回归分析结果显示术后早期出血量与术前Hb水平呈正相关（r=0.305，P=0.022），与术前FLEV水平呈负相关（r=-0.468，P=0.003）。多重线性回归分析结果显示，仅术前FLEV含量与术后早期出血量独立相关（r=-0.408，P=0.002）。 研究结论: 紫绀型先天性心脏病患儿体外循环预充液中加入血浆可以提高术后纤维蛋白原的水平，但不能明显降低术后的出血量和血液制品的使用量，对术后恢复也没有明显的促进作用。因此，在紫绀型先心病体外循环中不推荐常规预充血浆。临床上科学合理的使用人工胶体（在推荐剂量范围内并且检测血浆胶体渗透压）替代血浆可安全有效的用于此类患儿体外循环管路预充。TEG可用于先心病患儿术中以及术后凝血功能的实时监测，并在预测术后出血的风险和指导成分输血中发挥重要作用。
新鲜冰冻血浆;体外循环;先天性心脏病;血栓弹力图;凝血功能;小儿心脏手术;无血浆预充策略
北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院
博士
麻醉学
龙村
2015
中文
R654.2;R541.1
115
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）