Wip1基因敲除对急性肝损伤的影响及其机制研究
背景:肝脏作为人体内最大的器官，构成体重的2.5％。肝脏的血液供应占全部血液循环的25％，分别通过门静脉和肝动脉流入肝门，其中前者贡献了肝脏全部血供的75-80％和全部氧供的＞50％。热缺血再灌注损伤是临床中非常常见的急性肝损伤，肝脏手术中经常应用的Pringle manoeuvre是造成热缺血再灌注损伤的主要原因。目前研究发现，肝脏缺血再灌注损伤受到众多调控机制的共同作用，包括血窦内皮细胞和NO共同介导的血窦内压力改变[1]、Kupffer细胞介导的固有免疫反应[2，3]以及ATP耗竭介导的肝细胞坏死和caspase介导的细胞凋亡等。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控细胞凋亡、自噬、生长和再生及蛋白质合成方面发挥重要调控作用，已有研究发现PI3K/Akt激活的下游凋亡和自噬通路调控肝脏缺血再灌注[8]，同时也有研究发现Rapamycin抑制mTORC1功能从而激活mTORC2-Akt通路从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。Wip1（Wild-type p53 induced phosphatase1）是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，研究发现其在机体免疫调控看、炎症发生过程中发挥作用，但目前尚无研究报道Wip1在肝脏缺血再灌注过程中的作用。本研究利用2/3肝脏热缺血再灌注模型研究wip1基因在急性肝损伤中的作用，并初步探索Wip1对于肝脏缺血再灌注影响的机制。 方法: 1.将129sv背景的wip1基因敲除小鼠和C57BL/6背景的野生型小鼠进行杂交，以获得C57BL/6纯合背景的wip1基因杂合小鼠，并进一步获得wip1基因敲除小鼠。 2.10～14周龄wip1基因敲除小鼠作为实验组小鼠，同窝同性别小鼠作为对照组小鼠，建立2/3肝脏热缺血再灌注模型，缺血时间为60min、90min，术后6h、24h提取小鼠血液和肝脏，测血清ALT水平，H&E染色观察组织学改变，TUNEL染色统计细胞凋亡率，Western Blot检测肝组织Wip1、Akt、mTOR、p70 S6K、S6蛋白及相应磷酸化水平的改变，RT&Real-time PCR检测肝组织wip1基因转录水平的改变。 结果: 1.缺血60min，再灌注6h后，小鼠血清ALT水平分别为:野生型小鼠1172.5±237.1U/L，wip1-/-小鼠851.3±270.9U/L（P＜0.01）;假手术组小鼠ALT水平分别为:野生型小鼠44.3±11.3U/L，wip1-/-小鼠56.6±12.9U/L（P=0.369）。与同窝对照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠肝脏损伤轻。 2.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝组织石蜡切片H&E染色结果为:野生型小鼠Suzuki评分为7.75±0.43，wip1-/-小鼠为5.25±0.43(P＜0.01)。与同窝对照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠组织病理学改变轻。 3.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝组织石蜡切片TUNEL染色结果为:野生型小鼠凋亡率约为62.3％±5.6％，wip1-/-小鼠约为30.4％±3.7％(P＜0.01)。与同窝对照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠凋亡率低。 4.缺血90min，再灌注6h后，野生型小鼠肝组织Wip1蛋白表达量有所下降;与同窝对照野生型小鼠相比，wip1-/-小鼠肝组织mTOR、phospho-mTOR(Ser2448)、Akt、S6蛋白水平无显著差异，phospho-Akt(Ser473)、phospho-p70S6K(Thr389)蛋白水平明显升高，phospho-S6(Ser235/236)蛋白水平有所升高，phospho-mTOR(Ser2481)蛋白水平较损伤前有所下降。 结论:wip1基因敲除后肝脏缺血再灌注损伤减轻，可能与Wip1敲除后促进PI3K/Akt/mTOR通路进一步激活，并通过下游蛋白对细胞凋亡的调控完成。
急性肝损伤;热缺血再灌注损伤;wip1基因;免疫调控;细胞凋亡
中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院
博士
临床医学
毛一雷
2015
中文
R575.02;R392.13
50
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）