胰腺癌前病变小鼠模型血清早期诊断microRNA的筛选研究
背景：胰腺癌发病机制复杂，难以早期诊断，临床上确诊胰腺癌患者的手术可切除率低，术后生存期相对其他肿瘤较短。然而，关于胰腺癌发病机制的研究表明，胰腺癌的发生经历了相当长的过程，从获得关键的致病基因突变、逐渐发展为胰腺癌前病变、最终发展为胰腺癌，需要经历大约十年的时间。胰腺癌前病变如能早期诊断、及时治疗，可提高该疾病的治疗效果;然而，临床上缺乏早期筛查胰腺癌前病变的标志物。MicroRNA是一种22个碱基长度的核糖核酸，能在血清中稳定存在，是一种潜在的血清诊断标志物。KrasG12D突变转基因小鼠通过胰腺细胞特异性启动子，仅在胰腺细胞内产生具有致癌活性的KrasG12D突变蛋白;该小鼠可自发经历“正常胰腺-胰腺癌前病变-胰腺癌”过程。通过构建繁殖KrasG12D突变小鼠，并在胰腺癌前病变阶段留取小鼠外周血清，通过microRNA芯片和实时定量PCR的方法，定量测定KrasG12D小鼠外周血清中特异性高表达的microRNA，为临床筛选胰腺癌前病变的候选分子。 目的： 1.饲养KrasG12D转基因小鼠，无药物干预，培养胰腺癌前病变自然病程组小鼠; 2.通过雨蛙肽，诱导KrasG12D突变转基因小鼠产生胰腺炎，培养胰腺炎-胰腺癌前病变组小鼠; 3.通过microRNA芯片，筛选出胰腺炎-胰腺癌前病变中血清高表达microRNA; 4.通过生物信息方法，筛选出microRNA分子作为验证对象; 5.通过实时定量PCR，检测候选的microRNA在胰腺癌前病变血清的表达来量。 方法： 1.通过剪取小鼠鼠尾，消化，提取DNA;再通过特异性引物，扩增KrasG12D突变基因和Cre重组酶基因;进而确定小鼠基因型; 2.通过腹腔注射雨蛙肽，诱导KrasG12D突变转基因小鼠产生胰腺炎;再通过控制不同注射时间段，得到不同程度的胰腺炎-胰腺癌前病变;通过小鼠解剖，胰腺取材、固定、脱水、包埋等步骤，将不同阶段胰腺炎-胰腺癌前病变小鼠的组织进行保存; 3.通过苏木精-伊红染色，显微镜下随机取视野，并按照国际通用的胰腺癌前病变评分系统对胰腺癌前病变进行评分。通过免疫组化染色，评价胰腺浸润的免疫细胞种类和数量; 4.通过小鼠眼球后静脉取血，采集小鼠自然病程过程中外周清; 5.通过microRNA芯片，对小鼠血清中的microRNA丰度进行测定。通过严密的后期计算分析，筛选出胰腺炎-胰腺癌前病变中高表达的血清microRNA指标; 6.通过生物信息方法，筛选出在胰腺癌或癌前病变的组织或血样中高表达的microRNA; 7.通过实时定量PCR的方法，对于芯片中筛选出的microRNA进行逐一筛选。进而确定在小鼠胰腺癌前病变中高表达的microRNA。 结果： 1.通过小鼠鉴定，繁殖，饲养，实验中一共饲养了小鼠143只，其中LSL-KrasG12D阳性且Pdx1-Cre阳性的双阳性突变转基因小鼠15只; 2.胰腺炎-胰腺癌前病变组中双阳性小鼠6只; 3.胰腺癌前病变自然病程组双阳性小鼠9只; 3.通过苏木精-伊红染色、评分，确定了全部KrasG12D突变小鼠均有胰腺癌前病变，免疫组化评价了胰腺内浸润的免疫细胞种类; 4.通过microRNA芯片检测及统计学分析，筛选出在胰腺炎-胰腺癌前病变组血清中高表达microRNA共54个，其中文献中报告过具有胰腺癌或胰腺癌前病变组织特异性的有10个。通过实时定量PCR检测，发现miR-210-3p的microRNA在胰腺癌前病变外周血清中高表达。 结论：KrasG12D突变转基因小鼠可模拟胰腺癌前病变过程，该动物模型血清中筛选microRNA的策略可行，miR-210-3p是胰腺癌前病变潜在分子标记物。
胰腺癌;癌前病变;早期诊断;血清microRNA;KrasG12D突变蛋白;分子标记物
中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院
博士
临床医学
赵玉沛
2015
中文
R735.9;R730.43
59
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）