心肌缺血再灌注损伤中SyntaxiN-1A的作用及保护性药物筛选
背景:围术期心脏缺血再灌注损伤(IRI)发生率高，在非心脏手术中的发生率也达到1％-4％，而且预后不良，增加了住院病人的发病率和死亡率。多种方法和药物，包括缺血预处理(IPC)和腺苷(adenosine)等，都用于减少围术期心肌缺血再灌注的发生以改善病人的预后。除此之外，吸入性全麻药如异氟烷和七氟烷也具备心肌缺血再灌注损伤的保护作用。然而吸入性全麻药和缺血预处理的作用机制仍不清楚，而且对于临床围术期心肌缺血再灌注损伤仍缺乏有效的治疗手段。 吸入性全麻药和缺血预处理通过相似的细胞信号通路发挥作用，例如PI3K/AKT/GSK3β，ERK1/2，JNK/STAT3，PKC，KATP通道等。这些现象提示可能存在同时受这两种方法调控的心肌保护靶点。近期的研究表明，膜蛋白syntaxin-1A可能就是其中之一。本课题拟研究syntaxin-1A在心肌缺血再灌注损伤中的作用，并探索新型缺血再灌注损伤的治疗手段。 第一部分 Syntaxin-1A介导了异氟烷预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 目的:Syntaxin-1A广泛的分布在神经系统、内分泌系统、心脏和其他各组织器官。研究发现，syntaxin-1A能够调节心肌缺血再灌注损伤相关的信号通路，如KATP通道和钙离子通道的开放。Syntaxin-1A在组织缺血时表达上调。这些结果提示syntaxin-1A在心肌缺血再灌注损伤中的作用。更重要的是，研究发现吸入性全麻药异氟烷和氟烷能够与膜蛋白syntax in-1A结合。本研究假设一:缺血再灌注损伤、缺血预处理和异氟烷预处理能够调控心肌syntaxin-1A表达水平。假设二:心肌细胞syntaxin-1A表达水平变化能够影响缺血预处理和异氟烷预处理产生的心肌缺血再灌注保护作用。假设三:syntaxin-1A通过调节上述PI3K/AKT/GSK3β，ERK1/2,JNK/STAT3，PKC信号通路的活化来发挥保护作用。 方法:实验分为五组:SHAM（对照组）;Iso（异氟烷组，1.5％）;IR（缺血再灌注组）;IPC（缺血预处理组）;Iso-PC（异氟烷预处理组）。并利用重组腺病毒转染干扰或过表达原代心肌细胞中syntaxin-1A的表达水平。实验一:通过SD大鼠在体心肌缺血再灌注模型和原代细胞离体缺氧复氧模型的建立，利用western blot观察再灌注4小时和24小时后syntaxin-1A在各处理组中表达水平的变化，并检测心肌损伤指标，包括血清肌钙蛋白cTnT，细胞活力，和细胞凋亡率。实验二:利用大鼠原代心肌细胞的缺氧复氧模型，通过重组腺病毒转染技术上调或下调syntaxin-1A的表达水平，观察各实验组原代细胞缺氧损伤的变化。采用MTT法检测心肌细胞活力;采用流式细胞仪AnnexinⅤ-APC/PI法检测细胞凋亡率。实验三:Syntaxin-1A保护心肌缺血再灌注损伤的通路机制研究。采用western blot技术检测上调或下调syntaxin-1A表达水平后，心肌保护性信号通路的活化情况，包括ERK1/2、AKT、GSK3β和STAT3磷酸化活化程度;PKC蛋白表达水平。 结果: 实验一:在体和细胞模型实验同时表明，缺血再灌注损伤能使心肌syntaxin-1A表达上调，而缺血预处理和异氟烷预处理能使syntaxin-1A的表达进一步上升。实验二:利用重组腺病毒转染技术调控syntaxin-1A的表达水平能够影响缺氧复氧损伤诱发的心肌细胞凋亡和细胞活力;同时，利用siRNA技术降低syntaxin-1A的表达能够阻断异氟烷预处理产生的心脏保护效应，但对缺血预处理的作用影响不大。实验三:缺血再灌注损伤能上调ERK1/2，STAT3，AKT和GSK3β的磷酸化水平以及PKC的表达水平;同时，syntax in-1A表达下调后能明显激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路，但上调其表达对PI3K/AKT/GSK3β信号通路影响不大。 结论:Syntaxin-1A能够对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用，并且可能是异氟烷预处理发挥心肌缺血再灌注损伤保护作用的的靶蛋白。Syntaxin-1A的表达调控与PI3K/AKT/GSK3β信号通路的活化相关。 第二部分二次缺氧损伤保护性药物的高通量筛选 目的:在缺血损伤发生后，两种完全不同的病理生理学过程造成了组织细胞的死亡。细胞自发的死亡机制在前期已经得到很好的研究和阐述，包括细胞的坏死和凋亡等。另一方面，缺血后已经死亡的细胞可以释放小分子来促进周围细胞的死亡。钾离子和谷氨酸被证明从缺氧损伤的神经元释放并诱发周围神经元的死亡。这种缺氧损伤后细胞的非自发性死亡被称为“二次缺氧损伤”。这种现象在临床上被认为更加重要，因为这些细胞遭受缺氧损伤指出仍然是存活的，例如脑卒中的“半影区(Penumbra)”和心梗中的危险区域(Area at Risk，AAR)。 目前在临床上围术期缺血再灌注损伤发生后，仍缺乏有效的治疗措施。前瞻性药物筛选方法能够为发现未知药物和药物的未知功能提供可能性。本实验拟进一步实验一:构建针对二次缺氧损伤保护性药物的高通量筛选模型。实验二:利用构建的高通量筛选模型筛选具有二次缺氧损伤保护作用的潜在药物。 方法:研究采用了秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)突变型虫系gc47∶gcIs3作为动物模型。该虫系具有rars-1(gc47)突变背景，但咽部表达野生型基因。该突变型gc47是位于秀丽隐杆线虫3号染色体左臂上编码rrt-1基因的第811核苷酸甘氨酸残基(G)突变为丙氨酸残基(A)，使精氨酸-tRNA合成酶的功能降低，从而蛋白合成效率降低。突变型gc47对缺氧有出色的耐受性，而gc47∶gcIs3虫系在缺氧损伤后的4-6天里逐渐受损乃至死亡。本部分实验一:利用秀丽隐杆线虫突变型虫系gc47∶gcIs3构建二次缺氧损伤高通量筛选的实验模型。实验二:选取MicrosourceDiscovery System公司的Spectrum Collection化合物库，包含2000种不同的药物，其中包括1000种临床药物，580种自然提取物和420种具有生物活性的化合物。利用已构建的高通量筛选模型，寻找对二次缺氧损伤具有保护作用的潜在药物。 结果: 实验一:通过实验，构建了一套以突变型gc47∶gcIs3虫系为实验对象的高通量药物筛选模型。缺氧时间27小时为最佳实验时间;缺氧后96小时后为评价时间节点;评价指标包括线虫的形态、运动、大小等;并通过小型筛选实验成功筛选出阳性对照药物多西环素。实验二:经过第一轮筛选，从2000种药物中得到125种具有潜在保护作用的药物;从中选取80种药物，建立浓度梯度，进行第二次筛选，得到16种保护药物;第三轮筛选采用常规缺氧损伤实验方法，经过反复验证，最终明确2种具有二次损伤保护作用的新型药物。 结论:本实验构建的高通量药物筛选模型能成功地筛选出对二次缺氧损伤有保护作用的阳性药物。新药物的发现，将为临床围术期心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路。
再灌注损伤;异氟烷;药物筛选;心肌缺血;信号通路
第二军医大学
博士
麻醉学
石学银
2015
中文
R614.2
95
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）