miR-330抑制脊髓神经元的GABAB受体功能介导胰腺癌痛的机制研究
MicroRNAs是一种的小内源性非编码核苷酸片段，约19-23个核苷酸，能够通过翻译抑制或靶目标mRNA降解来调节基因的表达。越来越多的研究显示miRNAs有可能在神经系统疾病的发生和维持中发挥着至关重要的作用。由于其特异的靶目标属性，一个单一的miRNA可以同时结合和调节多个目标基因序列。有学者提出miRNAs作为基因序列表达的总开关，对于正常机体活动是必不可少的，一旦其功能活动受到影响，极可能导致身体病理性疾病的发生。但是，miRNA数量巨大，目前为止，经miRNA数据库(miRbase)确认的数量已经达到1000多种，因此，其具体作用及机制还有大量的内容等待我们去发现。MicroRNAs参与疼痛相关神经活动的调节，成为最近几年在疼痛研究领域令人关注的热点。 临床上，胰腺癌癌痛发生率高，缺乏有效治疗手段，严重影响患者生存质量。本研究通过基因芯片分析首次发现，在有痛觉过敏的胰腺癌裸鼠模型脊髓后角miR-330表达升高，而无明显痛觉过敏的胰腺癌模型裸鼠和正常裸鼠之间，miRNA-330的表达无明显差异，强烈提示其可能在胰腺癌痛发生过程中发挥重要调节作用。进一步地，我们经基因数据库筛查分析发现，中枢主要促代谢型抑制性受体GABAB的B2亚型可能是miR-330的调控作用位点。所以，我们在之前着重外周神经在胰腺癌痛中作用研究基础上，本论文将利用原代培养的脊髓后角神经元，结合基因操作、分子生物学和电生理实验技术，重点关注miR-330高表达抑制脊髓后角神经元中GABAB2受体表达及其相应功能，进而导致胰腺癌痛发生的可能机制，为胰腺癌痛的机制研究和临床治疗提供新的思路。实验结果如下: 1.脊髓后角miR-330高表达可能导致胰腺癌痛发生。 1)在有痛觉过敏的胰腺癌裸鼠模型脊髓后角，相比较于无明显痛觉过敏的胰腺癌模型裸鼠和正常裸鼠，术后7天、21天miR-330mRNA表达的显著升高，有统计学意义。而胰腺癌裸鼠模型中无痛觉过敏组与正常裸鼠相比，miR-330的表达并未发现明显改变; 2)在培养的脊髓后角神经元上，经慢病毒转染高表达miR-330，电生理实验检测神经元细胞兴奋性升高，其自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)的波幅和频率都显著上升，与正常对照组比较有统计学意义。给予10μM baclofen处理后，能显著抑制其波幅和频率。说明miR-330可以通过突触前与突触后机制调节脊髓神经元活性。 2.miR-330抑制GABAB2受体功能的机制。 1)在裸鼠胰腺癌痛模型，脊髓后角GABAB2的受体术后7天、14天、21天、28天表达下降，术后14天时GABAB2下降达到峰值，至术后21天，情况有所恢复。这与裸鼠7天后开始有痛觉过敏的行为学表现的出现时间相符合。 2)脊髓后角神经元正常培养7天后进行转染，随机分为三组，正常对照组，转染空病毒组(vehicle组)，转染miR-330病毒组。转染48h后，Western blot检测发现，与正常对照组相比， GABAB2受体的表达在vehicle组稍有下降，在转染miR-330组显著下降;而与GABAB2的表达不同，培养7天同样进行miR-330慢病毒转染的神经元中，vehicle组与转染miR-330组GABAB1的表达下降不明显，为(0.87±0.20)、(0.94±0.24)，与正常组比较都没有统计学意义; 3)双荧光素酶报告基因方法检测发现，miR-330能通过与GABAB2基因的3'UTR结合，抑制GABAB2基因的表达; 4)给予谷氨酸处理，发现神经元细胞膜GABAB2和GABAB1的表达都发生了下降，揭示兴奋性神经递质可以调控神经元细胞膜蛋白的表达。 综上所述，在裸鼠胰腺癌痛模型中脊髓后角miR-330表达的显著升高，抑制GABAB2的受体，增强痛觉信息在脊髓后角的传递，从而介导胰腺癌痛敏的发生。miR-330有可能成为一个有吸引力的潜在治疗靶点。
胰腺癌;脊髓后角神经元;痛觉过敏;临床治疗;慢病毒转染
第二军医大学
博士
麻醉学
俞卫锋
2015
中文
R735.9
89
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）