氯化血红素诱导的血红素加氧酶-1在脓毒症小鼠骨骼肌萎缩中的作用
[研究目的] 肌萎缩是脓毒症患者远期和严重并发症之一，严重影响患者生活质量。脓毒症导致肌纤维蛋白分解加速是肌萎缩发生的重要原因。泛素/蛋白酶体系统活性升高，促炎细胞因子高表达和氧化应激损伤等是脓毒症时肌纤维降解加速的主要原因。氯化血红素(hemin)可诱导血红素加氧酶-1(HO-1)表达升高。HO-1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，但其对脓毒症相关肌萎缩是否有保护作用尚无报道。本文首先通过观察脓毒症小鼠后肢肌肉萎缩程度及病理学改变，研究hemin是否对脓毒症相关肌萎缩具有保护作用;其次，通过测定小鼠外周血促炎细胞因子、骨骼肌HO-1及肌萎缩相关分子表达水平等，探究hemin在脓毒症相关肌萎缩中的可能作用机制。 [研究方法] 1、建立小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型，并按不同处理方式分为四组:假手术组、CLP组、hemin组及锌原卟啉(ZnPP，HO-1抑制剂)组。其中，假手术组及CLP组小鼠予以腹腔注射2％ DMSO水溶液200μl处理;hemin组小鼠予以腹腔注射hemin(50mg/kg)200μl; ZnPP组腹腔注射hemin(50mg/kg)和ZnPP(20mg/kg)共200μl。其中，假手术组小鼠仅探查肠管未结扎穿孔。各组小鼠给药时间为术前5d、3d、1d。此实验手术及取材前小鼠均在2％～3％七氟烷全麻后进行。 2、术后3d取各组小鼠后肢，分离皮肤后大体观察骨骼肌形态;手术当日及术后1d、3d、5d和7d时，分离小鼠比目鱼肌并称量肌肉湿重，初步判断各组小鼠骨骼肌萎缩程度及变化。 3、术后24h利用酪氨酸测定法，测定各组小鼠比目鱼肌降解后释放的酪氨酸浓度，以分析骨骼肌蛋白降解程度。 4、术后5d取小鼠胫骨前肌，使用4％多聚甲醛固定并作石蜡切片，在光学显微镜下观察并计算各组小鼠骨骼肌纤维横截面积变化。 5、分别于术后1d、4d和7d时分离小鼠胫骨前肌，采用实时定量PCR法(RT-PCR)测定骨骼肌组织HO-1的mRNA表达水平;术后1d取小鼠胫骨前肌，使用Western蛋白印记方法(Western-blotting)测定骨骼肌HO-1蛋白表达水平;术后24h测定小鼠胫骨前肌胆红素水平，以评估HO-1活性。 6、术后24h时经小鼠心脏取血，使用血浆酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组小鼠外周血IL-6及TNF-α浓度。 7、分别于术后1d、4d和7d时采用RT-PCR法测定小鼠胫骨前肌萎缩相关基因-1(atrogin-1)和肌肉环状指分子1(MuRF1)的mRNA表达水平;术后1d使用Western-Blot法测定胫骨前肌atrogin-1和MuRF1的蛋白表达水平。 8、术后24h在全麻下迅速分离小鼠胫骨前肌，液氮冻存。使用分光光度计法测定肌组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)浓度和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，分析各组小鼠骨骼肌氧化应激损伤程度。 [结果] 1、术后3d CLP组小鼠后肢较假手术组显著变细，hemin组较CLP组有所改善;ZnPP组小鼠后肢与CLP组相似，均发生较显著的肌萎缩现象。假手术组小鼠在术后0d～7d内比目鱼肌重量无显著改变，CLP组比目鱼肌重量呈显著下降，hemin组比目鱼肌重量也呈下降趋势，然较CLP组下降程度减慢，术后3d、5d和7d时与CLP组比较差异有统计学意义。ZnPP组与CLP组小鼠比目鱼肌重量下降差异无统计学意义。 2、使用酪氨酸测定法检测肌肉分解所释放的酪氨酸浓度，结果显示CLP组酪氨酸浓度高于假手术组近2倍，hemin组酪氨酸浓度较CLP组低，ZnPP组酪氨酸浓度高于假手术组和hemin组，但与CLP组比较差异无统计学意义。 3、光学显微镜下观察小鼠胫骨前肌横截面，发现CLP组和ZnPP组肌纤维较假手术组显著变细，hemin组肌纤维较CLP组改善。计算各组肌纤维横截面积，结果显示CLP组较假手术组显著缩小，hemin组肌纤维面积较CLP组增大，ZnPP组横截面积较hemin组减小，与CLP组相比差异无统计学意义。 4、各组小鼠外周血ELISA结果显示，术后24h CLP组小鼠IL-6及TNF-α水平显著高于假手术组，hemin组IL-6及TNF-α水平低于CLP组，ZnPP组上述两种炎性因子表达水平与CLP组差异无统计学意义。 5、RT-PCR结果显示，术后1d、4d和7d时hemin组和ZnPP组骨骼肌HO-1 mRNA表达水平均高于假手术组和CLP组，但HO-1表达整体呈下降趋势。 Hemin组骨骼肌atrogin-1和MuRF1表达水平均显著低于CLP组。通过测定胆红素浓度分析HO-1活性，发现术后24h hemin组肌肉HO-1活性高于CLP组，但ZnPP组HO-1活性显著低于hemin组。 6、Western-blotting结果显示，CLP组小鼠骨骼肌组织HO-1蛋白表达略高于假手术组，hemin组和ZnPP组HO-1表达显著高于假手术组和CLP组。CLP组肌组织atrogin-1和MuRF1蛋白表达均显著高于假手术组，hemin组两者表达均低于CLP组，ZnPP组atrogin-1和MuRF1均为高表达。 7、CLP组小鼠胫骨前肌MDA浓度显著高于假手术组，hemin组MDA浓度低于CLP组，ZnPP组MDA浓度与CLP组比较差异无统计学意义。SOD活性测定显示hemin组小鼠骨骼肌组织SOD活性高于CLP组，ZnPP组SOD活性与CLP组比较差异无统计学意义。 [结论] Hemin可减轻脓毒症小鼠骨骼肌萎缩程度，其机制可能与hemin诱导小鼠骨骼肌HO-1高表达和活性增加有关。HO-1活性增加可抑制促炎细胞因子IL-6及TNF-α分泌，降低泛素/蛋白酶系统中肌萎缩相关分子atrogin-1和MuRF1的表达，并减轻骨骼肌组织氧化应激损伤，从而对脓毒症诱导的骨骼肌萎缩产生一定的保护作用。
氯化血红素;血红素加氧酶;脓毒症;肌萎缩;蛋白酶;氧化应激
第二军医大学
硕士
麻醉学
邓小明
2015
中文
R746.4
60
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）