脓毒症急性肺损伤时HSPA12B对肺血管通透性的影响及其机制
脓毒症是临床上常见的、严重威胁病人生命的感染性综合征，进一步发展导致脓毒症休克、多器官功能损伤，发病率及死亡率高。其中，急性肺损伤(ALI)是脓毒症最常见的并发症之一，其发生发展的关键机制是肺内皮屏障功能障碍，肺血管通透性增加，进一步导致肺水肿、严重低氧血症。肺血管通透性增加是其主要的病理生理特征。因此，保护肺血管内皮细胞、维持正常的肺内皮屏障功能及肺血管通透性对于ALI的干预治疗具有重要的临床意义。 热休克蛋白A12B(HSPA12B)是HSP70超家族中的一员，不同于其他热休克蛋白，它主要表达于血管内皮细胞，是内皮细胞特异的热休克蛋白，参与了血管的生成与稳定。HSPA12B表达上调可以减轻脓毒症导致的心功能障碍，也可以减轻缺血再灌注时脑组织的损伤。但是，HSPA12B对脓毒症时肺脏功能有无保护作用，尤其是对肺内皮通透性有无影响及其可能的机制，尚未见研究。 本研究通过离体与在体实验，探讨脓毒症时HSPA12B对内皮细胞通透性的影响及其可能的机制。离体实验，采用脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，研究HSPA12B的表达变化情况及其发生变化的可能机制;构建HSPA12B过表达质粒，研究HSPA12B过表达对血管内皮细胞通透性的影响以及其作用机制。在体实验，采用鼻吸入经修饰的siRNA纳米微粒复合物的方法使小鼠的HSPA12B表达下调，然后构建CLP小鼠模型，颈外静脉注射EvansBlue dye，检测肺组织中Evans Blue dye含量以反应HSPA12B表达下调对脓毒症小鼠肺通透性的影响。 第一部分 LPS处理HUVEC时HSPA12B的表达变化及其可能机制 目的:探讨HSPA12B在LPS处理的HUVEC中的表达变化及其机制。 方法: 1.培养HUVEC，用终浓度为1μg/ml的LPS刺激HUVEC，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h收集细胞，应用RT-PCR法及Western blot法分别检测HSPA12B的mRNA及蛋白质水平。 2.培养HUVEC，分别用NF-κB、p38抑制剂(NF-κB inhibitor、SB203580)及其对照试剂DMSO对细胞进行预处理，然后用LPS刺激HUVEC，12h后收集细胞，Western blot法检测HSPA12B的蛋白质水平。 结果: 1.LPS处理HUVEC后，HSPA12B mRNA和蛋白质水平均在0-12h内逐渐升高，12h达高峰。 2.与DMSO相比，使用NF-κB inhibitor、SB203580后可以降低LPS诱导的HSPA12B的蛋白质表达水平。 结论：内毒素对HUVEC中HSPA12B表达具有一定影响，HSPA12B的表达在0-12h内逐渐升高，12h达高峰，随后开始下降;LPS诱导的HSPA12B表达的改变与NF-κB、p38信号通路相关。 第二部分 HSPA12B对LPS诱导HUVEC通透性改变的影响 目的：研究HSPA12B表达上调对LPS诱导的HUVEC通透性改变的影响。 方法：HUVEC分为4组:①control组（未进行任何处理）;②LPS（1μg/ml）组;③LPS+HSPA12B高表达组（转染质粒pIRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B）;④LPS+阴性对照质粒组（转染pIRES2-EGFP-3Flag）。分别进行相应的处理后，检测HUVEC的跨内皮电阻抗(TEER)值。 结果：control组、LPS组、(LPS+HSPA12B高表达)组、（LPS+阴性对照质粒）组的TEER值分别为:36±2Ω、25±1Ω、28±1Ω、45±2Ω。与LPS组和(LPS+阴性对照质粒)组比较，HSPA12B高表达组的TEER值均明显升高。 结论：HSPA12B可以降低LPS刺激下HUVEC的通透性，可能对血管内皮屏障功能有保护作用。 第三部分 HSPA12B影响HUVEC通透性的可能机制 目的：探讨HSPA12B对LPS刺激下HUVEC通透性的影响机制。 方法：将HUVEC分为四组:①control组（未进行任何处理）;②LPS（1μg/ml）组;③LPS+HSPA12B高表达组（转染质粒pIRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B）;④LPS+阴性对照质粒组（转染pIRES2-EGFP-3Flag）。LPS处理12h后收集细胞，Westernblot法检测粘附分子VE-cadherin、ICAM-1、E-selectin的表达，以及通透性相关激酶MLC、SRC、cdc42的表达及其活性;免疫荧光检测VE-cadherin的表达水平。 结果：Western blot检测结果表明:HUVEC经LPS刺激12h后，与转染阴性对照质粒组相比，HSPA12B高表达组的粘附分子VE-cadherin表达水平明显上调;HSPA12B高表达组的激酶MLC、SRC、cdc42的表达也增强，而其活性形式P-MLC、P-SRC、P-CDC42水平并无差异。免疫荧光结果显示，HSPA12B高表达组的VE-cadherin水平也升高。 结论：结合第二部分的实验结果，本部分结果提示:LPS刺激下，HSAP12B可能通过上调粘附分子VE-cadherin的表达，降低HUVEC的通透性;也可能通过增加血管内皮通透性相关的激酶MLC、SRC、CDC42的表达，降低HUVEC的通透性，从而起到保护血管内皮屏障功能的作用。 第四部分 HSPA12B对脓毒症肺损伤小鼠肺通透性的影响 目的：在体研究HSPA12B表达下调对脓毒症急性肺损伤小鼠肺通透性的影响。 方法：实验小鼠随机分为四组:sham组、CLP组、NC-CLP组、HSP12B-siRNA-CLP组。小鼠经鼻吸入修饰的siRNA纳米微粒复合物，CLP术后30h，经颈外静脉注射Evans Blue，2h后取肺组织检测EB染料的含量。 结果：肺组织大体观显示:较NC-CLP组，HSPA12B-siRNA-CLP组小鼠肺组织明显变蓝。肺组织Evans蓝的含量检测结果显示，sham组、CLP组、NC-CLP组、HSP12B-siRNA-CLP组小鼠肺组织EBD的含量分别为:10.28±0.72μg/g、12.22±0.37μg/g、11.97±0.79μg/g、15.65±2.36μg/g。与NC-CLP组相比，HSPA12B-siRNA-CLP组小鼠肺组织Evans蓝的含量明显增多。 结论：HSPA12B表达下调后小鼠肺组织Evans蓝含量明显增多，表明肺通透性增加，肺血屏障功能受损。提示:脓毒症急性肺损伤时，HSPA12B高表达可能可以降低肺通透性，保护肺血屏障功能。
热休克蛋白;脓毒症;肺损伤;肺通透性;血管内皮细胞
第二军医大学
硕士
麻醉学
朱科明
2015
中文
R631
71
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）