miR-330下调脊髓后角GABAB2受体参与慢性胰腺炎痛敏机制的研究
研究目的:疼痛是90％的慢性胰腺炎患者和晚期胰腺癌患者的主要症状，常表现为反复剧烈发作且持续时间长，严重影响患者的生活质量。根据已有的慢性胰腺炎痛敏发生机制提出的镇痛措施往往不能令患者满意。同时，在临床上观察到，绝大多数胰腺癌癌痛患者存在胰腺组织的炎症性病变。因此，明确胰腺炎疼痛的致痛机制具有重要的临床意义。 microRNAs作为转录后的调节因子，可通过部分同源序列与目的信使RNA(mRNA)的3'非转录区结合，导致mRNA的降解或翻译的终止。关于miRNAs在疼痛机制中的研究发现，miRNAs与神经元的可塑性、神经元的发生、伤害感受的兴奋性、痛阈及慢性痛有关。前期的研究中，利用miRNAs芯片技术检测了裸鼠胰腺癌模型脊髓背角及正常裸鼠脊髓背角miRNAs的表达，结果发现microRNA330（miR-330）在癌痛发生组裸鼠脊髓背角的表达较正常裸鼠及无癌痛裸鼠显著升高，而无癌痛裸鼠组及正常裸鼠组miR-330的表达无明显差异。这提示miR-330可能与疼痛的调节密切相关。进一步利用基因数据库检测到miR-330的靶基因可能是表达GABAB2受体(GABAB2-R)的基因。GABAB2-R是GABAB受体的一个主要亚基，是GABAB受体发挥功能不可或缺的一部分。GABAB受体是抑制性神经递质GABA的主要受体之一，广泛存在于中枢和外周神经系统。在脊髓中，GABAB受体主要表达在脊髓背角浅层，该受体激活后可调节突触的可塑性和兴奋性，从而在疼痛的发生和调节中发挥重要的作用。 因此，miR-330是否通过下调GABAB2-R的表达，抑制GABAB受体的功能，参与慢性胰腺炎痛敏的发生，是本研究的主要目的。 研究方法: (1)鞘内注射慢病毒溶液转染miR-330，检测脊髓神经元转染miR-330后大鼠痛行为学变化。 (2)利用二丁基二氯化合物(DBTC)一次性尾静脉注射wistar雄性大鼠建立慢性胰腺炎模型。测量正常大鼠、DBTC注射后3d，7d，14d，21d大鼠腹部机械痛阈值。 (3)利用免疫组织化学法及Western-blot法检测了GABAB2-R在慢性胰腺炎模型大鼠胸8-胸12(T8-T12)节段脊髓背角蛋白水平的表达变化。 (4)利用免疫荧光组织化学法及RT-PCR法检测了GABAB-R在慢性胰腺炎模型大鼠T8-T12节段背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元上基因水平的表达变化。 (5)利用荧光素酶报告基因实验探讨miR-330与GABAB2-R基因的靶向关系。 实验结果: (1)脊髓神经元转染miR-330的大鼠腹部机械痛阈值较对照组大鼠显著下降。鞘内注射携带miR-330慢病毒和空载病毒后的5d、7d、14d、21d，测量大鼠的腹部机械痛。结果发现:注射慢病毒14d以后，转染miR-330组大鼠的腹部机械痛阈较空载病毒组明显下降，痛阈值由50g降低到10g。 (2)利用DBTC一次尾静脉注射法成功建立慢性胰腺炎模型，注射DBTC后3d，7d，14d，21d大鼠腹部机械痛阈值较正常大鼠下降。胰腺HE染色发现，DBTC注射组大鼠7d后，胰腺散在的腺泡细胞肿胀坏死，广泛的炎症细胞浸润及大量的纤维结缔组织增生。测量静脉注射DBTC后3d，7d，14d，21d大鼠及正常大鼠腹部机械痛阈值，结果发现:DBTC注射后3d大鼠腹部机械痛阈值显著下降，并且随时间延长，大鼠腹部疼痛的程度逐渐加重。 (3)免疫组化结果提示，GABAB2-R主要表达在与伤害感受密切相关的脊髓背角浅层。 (4)慢性胰腺炎大鼠T8-T12节段脊髓背角神经元上GABAB2-R的表达较正常大鼠显著下调。在建模后3d、7d、14d、21d测量腹部机械痛阈值，检测脊髓背角GABAB2-R的表达水平。结果发现:注射DBTC3d后在胰腺炎急性期，GABAB2-R的表达与正常大鼠GABAB2-R的表达差异无统计学意义，7d、14d、21d后在胰腺炎的慢性期，GABAB2-R的表达下调至正常组的1/3-1/2，并且其下调的趋势与慢性胰腺炎大鼠痛阈值下降的趋势一致。 (5)免疫荧光组织化学法发现:在大鼠T8-T12节段DRG神经元中，GABAB1-R及GABAB2-R广泛表达。慢性胰腺炎大鼠T8-T12节段背根神经节神经元上，GABAB-R的表达较正常大鼠显著下调。 (6)荧光素酶报告基因实验验证了GABAB2-R的基因是miR-330的一个作用靶点。实验结果表明miR-330能与GABAB2-R的基因GABBR2的3'UTR结合，抑制GABAB2-R表达。 结论:本研究结果表明， miR-330下调脊髓背角神经元GABAB2-R的表达，导致其去抑制，是慢性胰腺炎痛敏发生的可能机制之一。
胰腺炎;痛觉敏感;氨基丁酸;免疫组化;调节因子
第二军医大学
硕士
麻醉学
陆智杰
2015
中文
R657.51;R614
64
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）