梗阻性黄疸大鼠胸主动脉BKCa和KATP通道过度激活导致血管低反应性
背景与目的:全身血管对舒、缩血管的活性药物反应减弱或不反应即被定义为血管低反应性，主要表现为血管舒缩功能障碍以及顽固性低血压。大量临床研究发现，围术期梗阻性黄疸(OJ)病人也存在着周围血管阻力下降，血压下降，以及血管对内源性和外源性升压物质反应不敏感的情况，其具体机制目前仍不清楚。受体减敏、内环境紊乱、血管平滑肌细胞(VSMCs)膜超极化等均被认为是潜在机制。血管张力主要由血管平滑肌进行调节，而其中钾通道的功能对于调节血管平滑肌的舒缩节律至关重要。分布在血管平滑肌细胞上的钾通道主要有四个亚型:Kv（电压依赖性钾通道）、KATP（三磷酸腺苷敏感钾通道）、Kir（内向整流钾通道）、KCa（钙激活钾通道），其中又以BKCa（大电导钙激活钾通道）、KATP通道的发挥优势作用并且常作为各种内（外）源性血管收缩舒张调节机制的作用靶点，故本研究拟在离体动物实验水平以及分子生物学实验水平分别探究梗阻性黄疸大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞上钾通道是否存在结构或功能上的改变，并探讨该种改变对于梗阻性黄疸大鼠血管收缩和舒张功能的影响、及其与梗阻性黄疸血管低反应性之间的联系。 内容与方法:首先选取雄性Sprague-Dawley大鼠建立胆管结扎(BDL)模型，麻醉后分别取3、7、14天组BDL模型组大鼠、空白对照组和假手术组大鼠抽血检测肝功能指标，制备胸主动脉环测定各组大鼠离体胸主动脉血管环对不同浓度血管升压药物如去甲肾上腺素(NE)、去氧肾上腺素(PE)的收缩反应性情况以及离体动脉血管环对不同浓度血管扩张药物如硝普钠(SNP)的舒张反应性情况;分别用不同类型的钾通道阻断剂处理血管后（阻断血管平滑肌上相应的钾离子通道）观察记录离体血管环对NE的收缩反应性情况，比较用药（离子通道阻断剂）前后，各组大鼠血管对NE的反应性情况和收缩幅度的改变情况，据此推测各组大鼠血管平滑肌上钾通道的功能状况。此外，用离体实验比较了3、7、14天BDL大鼠血管低反应性与内皮之间的关系。急性酶解法分离得到大鼠胸主动脉平滑肌细胞，利用全细胞膜片钳技术分别记录正常大鼠和BDL大鼠VSMCsBKCa、KATP电流，再用特异性阻断剂北非蝎毒素(Chtx)和格列苯脲(Gllib)分别阻断BKCa和KATP通道后得到各组大鼠VSMCs特异性的BKCa、KATP电流。分子实验，从各组大鼠新鲜胸主动脉组织中提取RNA和蛋白样本，检测各胸主动脉组织中BKCa、KATP通道的各亚基(BKca-α、BKca-β1、SUR-2B、Kir6.1)蛋白及mRNA的表达水平。取动脉组织切片后，HE染色观察动脉组织病理学改变情况，免疫荧光染色观察胸主动脉组织中蛋白的表达和分布情况。 主要结果:结果发现，相较于正常组大鼠，BDL模型大鼠离体胸主动脉对于不同浓度梯度血管升压药物(NE、PE)的反应性显著下降，而对于血管降压药物(SNP)反应性显著增高。分别使用不同类型钾通道特异性阻断剂干预后我们发现，阻断BKCa、KATP后BDL大鼠胸主动脉血管环对血管升压药物的收缩反应较正常及假手术组大鼠胸显著恢复，而阻断Kv、Kir通道该现象不明显，初步提示BKCa、KATP通道参与导致BDL大鼠血管低反应性。利用全细胞膜片钳记录原代分离培养的大鼠胸主动脉VSMCs证实在BDL模型大鼠胸主动脉平滑肌细胞上BKCa电流、KATP电流强度显著增大，这一结果证实了BDL大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKCa、KATP通道存在过度激活。进一步实验中，分别提取Sham和BDL大鼠的新鲜胸主动脉组织进行分子生物学实验后发现，BDL大鼠胸主动脉BKCa通道以及KATP通道各自的辅助调节亚基BKCa-β1、SUR-2B在蛋白水平以及mRNA水平均出现不同程度的表达上调，而其各自的孔道组成亚基BKCa-α、Kir6.1的表达变化则不明显。胸主动脉组织切片HE染色后发现，BDL大鼠与Sham大鼠对比未见明显病理改变，而特异性荧光染色后也证实了血管平滑肌BKCa-β1、SUR-2B的表达上调。 结论:BDL模型大鼠胸主动脉血管对血管升压药物的收缩反应性显著减弱，对舒张药物的舒张反应性则增强，表现为梗阻性黄疸大鼠胸主动脉的血管低反应性。该低反应性早期为内皮依赖，7天后不再表现为内皮依赖。胸主动脉血管平滑肌上重要的钾通道BKCa和KATP通道在BDL大鼠离体血管及急性分离的血管平滑肌细胞(VSMCs)上均表现为过度激活，分子实验表明血管平滑肌BKCa和KATP两种钾通道的调节亚基BKCa-β1和SUR-2B表达量显著增高，提示BKCa和KATP通道的过度激活和功能增强导致平滑肌细胞兴奋性降低，进而参与梗阻性黄疸大鼠血管低反应性的病理过程。
梗阻性黄疸;胸主动脉;血管平滑肌细胞;血管低反应性
第二军医大学
硕士
麻醉学
俞卫锋
2015
中文
R575
70
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）