IFN-γ介导T细胞参与炎性痛慢性化机制的研究
目的：病理性疼痛（又称为慢性痛）已经成为全球最大疾病负担，炎性痛是临床病理性疼痛的主要类型之一。既往研究发现，在组织损伤或炎症发生后，脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞合成、释放多种促炎细胞因子、趋化因子和神经营养因子等，彼此相互影响，构成局部炎症微环境，最终增强兴奋性突触传递，即中枢敏化的形成，机体出现痛觉过敏和痛觉异常，但中枢敏化的长期维持或疼痛慢性化的关键机制仍不清楚。 近年来研究表明T细胞与神经病理性疼痛的慢性化相关。至于具体的T细胞亚型，现有证据趋向于Th1细胞，而Th17细胞的贡献还有待进一步研究。T细胞调控疼痛具体的分子作用机制，以及它们对炎性痛的发生、发展是否有影响及作用机制目前研究较少。 外周血T细胞参与脊髓对病理性疼痛的调控，就必须向由外周向脊髓募集，需要通过血-中枢神经系统屏障进入脊髓。炎性损伤发生后，脊髓胶质细胞激活产生的多种炎症因子如TNF-α、IL-1β、CCL2等可能会增加血-中枢神经系统屏障的通透性，提高对外周免疫细胞的趋化作用，其中星形胶质细胞更是参与了血-中枢神经系统屏障的构成。此外有研究发现小胶质细胞和星形胶质细胞在炎症等适宜刺激下可上调表达MHC-Ⅱ类分子，可能是中枢神经系统的抗原递呈细胞。据此我们推测T细胞能够浸润至脊髓发挥免疫效应，参与炎性痛的维持，而胶质细胞的活化尤其是星形胶质细胞的活化可能为此提供了必要条件。 方法：为验证以上推测，本课题利用单关节炎大鼠炎性痛模型和原代星形胶质细胞，运用免疫荧光组织化学方法、流式细胞术、蛋白质免疫印迹等实验方法，依以下步骤初步探讨T细胞对炎性痛的贡献、分子机制，以及胶质细胞对它的调节作用。 一、观察单关节炎大鼠脊髓腰膨大中T细胞数量及胶质细胞活化情况建立单关节炎大鼠(monoarthritis rats，MA)炎性痛模型，分离MA组和假手术组大鼠致炎后第7d、10d的脊髓腰膨大，检测T细胞数量、分布位置及活化情况，同时检测小胶质细胞离子型钙结合受体分子-1(Ionized calcium-binding adaptormolecule-1，Iba1)和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达水平，观察与比较T细胞数量与胶质细胞活化的动态变化。 二、分析探讨脊髓胶质细胞的活化状态与脊髓T细胞数量及活性的关系建立MA模型，通过药理学手段抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，检测机械缩腿反应阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)，以及脊髓腰膨大中T细胞数量及IFN-γ的表达水平，初步探讨胶质细胞活化对T细胞的调节作用。 三、分析探讨炎性痛大鼠脊髓IFN-γ表达与星形胶质细胞活化的相关性通过药理学手段改变MA及naive组大鼠脊髓IFN-γ的表达水平后检测PWT，以及星形胶质细胞GFAP的表达水平。并进一步检测经IFN-γ孵育后的原代星形胶质细胞中NF-κBp65的磷酸化水平，明确IFN-γ对星形胶质细胞的调节作用。 结果： 一、单关节炎大鼠脊髓腰膨大中T细胞数量及胶质细胞活化情况致炎后脊髓T细胞浸润及胶质细胞活化:脊髓腰膨大中的T细胞数目在致炎后第7d、10d明显增加，并且在第10d增加更显著。T细胞主要分布在脊髓背角。IFN-γ主要与T细胞标记CD3共标，而Th17标志性细胞因子IL-17主要与星形胶质细胞标记GFAP共标。在术后第7d和第10d，小胶质细胞lba1和星形胶质细胞GFAP表达水平均上调，其中Iba1和GFAP分别在第7d、10d上调更显著。 二、脊髓胶质细胞的活化状态与脊髓T细胞数量及活性的关系星形胶质细胞调节脊髓T细胞相关因子IFN-γ的表达水平:自术后第3天起经鞘内多次给药，与生理盐水组相比，应用小胶质细胞抑制剂—米诺环素后大鼠PWT、脊髓T细胞数量和IFN-γ的表达水平均无显著变化;运用星形胶质细胞抑制剂—氟代柠檬酸后，PWT明显升高， IFN-γ的表达水平显著下降，而T细胞的浸润数量无明显变化。 三、炎性痛大鼠脊髓IFN-γ表达与星形胶质细胞活化的相关性IFN-γ调节疼痛及星形胶质细胞活化:与磷酸盐缓冲液组相比，鞘内连续给予IFN-γ中和抗体可明显提高PWT，并下调星形胶质细胞GFAP的表达。而naive大鼠经鞘内给予重组IFN-γ后，与磷酸盐缓冲液组相比，能够引起PWT持续降低，并上调星形胶质细胞GFAP表达。体外IFN-γ孵育原代星形胶质细胞可增加星形胶质细胞中NF-κBp65的磷酸化水平。 结论：外周炎症发生后，T细胞可以向脊髓浸润，并活化分泌IFN-γ;而增加或降低脊髓IFN-γ的表达水平可直接诱发或缓解机触诱发痛及星形胶质细胞的活化。此外星形胶质细胞参与了炎性疼痛的维持，并调节脊髓IFN-γ的表达水平。 本研究提示Th1细胞可能通过分泌IFN-γ激活星形胶质细胞参与炎性痛的发展，反之，星形胶质细胞活化后可调控Th1细胞产生IFN-γ，协同推动炎性痛慢性化的形成。
病理性疼痛;炎性痛;T细胞亚型;脊髓胶质细胞;免疫效应;慢性化
第二军医大学
硕士
麻醉学
许华
2015
中文
R441.1;R614.41
66
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）