外侧缰核-腹侧被盖区尾部通路参与应激影响吗啡诱导条件位置偏爱的机制研究
药物成瘾已经被定义为一种慢性复发性疾病，成瘾的行为学特征包括:①强烈的药物渴求;②失去对服药行为的控制;③负性情绪的出现，如烦躁不安，焦虑和易怒等等。负性情绪的出现往往是服药需求不能得到满足而表现出的躯体戒断症状。需要强调的是，偶尔少量的或者娱乐性的服用精神兴奋性药物在临床上并不能称之为药物成瘾，只有机体对服药行为完全失去控制，出现强烈的药物渴求才称之为药物成瘾（或者药物依赖）。 几乎所有的成瘾性药物（阿片类药物、可卡因、甲基苯丙胺、大麻等等）都是通过影响中脑边缘多巴胺系统的活性，来实现其奖赏效应。以阿片类药物为例，它通过作用于位于腹侧被盖区尾部(tVTA)γ氨基丁酸(GABA)能神经元上的μ阿片受体(MOR)解除GABA能神经元对中脑多巴胺神经元的抑制，多巴胺神经元活性增加，释放到伏隔核(NAc)的多巴胺增加，产生欣快感。成瘾过程是一个极其复杂的生理过程，受到多种因素对多个环节（如成瘾的进展、维持以及戒断后的复吸等等）的影响。 应激在药物成瘾的起始阶段、维持阶段以及戒断后的复吸都扮演重要角色。有研究认为，应激性事件能够增加个体发展成为成瘾的概率;重复的强迫游泳应激能够增加可卡因的奖赏效应;应激与药物渴求之间存在正相关性;应激刺激有激活奖赏通路的作用。同时也有实验表明，慢性应激能够特异性的干扰奖赏相关的行为学表现;应激能够降低实验动物的成瘾行为学评分，甚至阻断某些成瘾行为的建立，如自身给药等。 最近在对抑郁的研究中发现，应激能够显著增加缰核神经元的代谢活性，足部电击小鼠能够增加从LHb到tVTA的兴奋性神经传入，运用光遗传学的方法激活这一兴奋性神经通路，能够诱发小鼠的主动性、被动型以及条件性的回避行为。缰核的活化被认为是与失望和预期的厌恶结果相关，恰好与多巴胺能神经元激活的结果相反，同时，临床上存在抑郁与药物成瘾的合并症。因此，我们推测游泳应激可能通过缰核神经元的活性，对中脑边缘多巴胺系统产生影响，进而干扰成瘾行为。 在本研究中，我们采用吗啡诱导条件位置偏爱模型，分别在SD大鼠和ICR小鼠中观察强迫游泳应激(FSS)对吗啡诱导条件位置偏爱(CPP)的影响;运用逆行追踪和顺行追踪的方法证明与成瘾和应激相关联神经核团（如LHb、VTA和tVTA等）之间的神经通路;应用免疫组织化学等方法寻找可能的内在分子生物学机制，我们的实验结果如下: 1.强迫游泳应激影响吗啡诱导条件位置偏爱的形成按照第1、3、5、7天腹腔注射吗啡(10mg/kg)，第2、4、6、8天腹腔注射生理盐水(10mg/kg)的给药建模方式，腹腔注射吗啡能够诱导SD大鼠和ICR小鼠产生明确的条件位置偏爱。在第1、3、5、7天腹腔注射吗啡(10mg/kg)或者第2、4、6、8天腹腔注射生理盐水(10mg/kg)之前，实验动物接受5分钟的FSS都能够降低测试阶段实验动物的CPP评分，说明躯体应激可以影响吗啡诱导CPP的形成，降低实验动物吗啡奖赏相关的行为学表现，并且这种干预作用不仅是短暂的，即给予吗啡之前接受应激处理，它同样出现在接受应激刺激后的24小时。15分钟的CPP测试时间里，实验动物在两侧箱体间的活动距离(distance traveled)不存在明显的统计学差异。说明FSS干扰吗啡诱导CPP的形成不是通过影响实验动物的自发活动来实现的。SD大鼠和ICR小鼠的实验结果相同。 2.成瘾和应激相关联核团之间神经解剖联系采用逆行追踪的方法，在大鼠脑立体定位仪的引导下，分别向SD大鼠的VTA（单侧）、tVTA（单侧）微量注射1μl Dil。追踪结果表明，存在从tVTA到VTA的GABA能神经投射;存在从LHb、DRN和杏仁核到tVTA的神经投射。 采用顺行追踪的方法，在大鼠脑立体定位仪的引导下，向SD大鼠的杏仁核微量注射1μl的表达GFP的AAV-CMV-GFP。追踪结果表明，存在从杏仁核到tVTA的神经投射。 3.应激可以导致外侧缰核神经元CaMKⅡ表达水平增高选用商业化的CaMKⅡ抗体（兔源性），采用免疫荧光的方法显示、分析评价各实验组大鼠大脑LHb神经元CaMKⅡ蛋白表达水平。免疫荧光结果显示:在生理盐水对照组和吗啡诱导建立CPP组大鼠脑内的LHb仅能够检测到微弱的特异性绿色荧光，说明这两组大鼠脑内LHb神经元表达极低水平的CaMKⅡ蛋白。而在另外两组接受FSS的大鼠脑内LHb能够检测到中等强度的特异性绿色荧光。应用Image-ProPlus6.0软件对免疫荧光图片进行统计分析，统计结果表明:与对照组相比，FSS能够显著增加大鼠LHb内CaMKⅡ蛋白的表达。说明反复的FSS激活了大鼠脑内LHb神经元。 4.应激可以影响吗啡对于伏隔核p-DARPP-32蛋白的升高作用选用商业化的p-DARPP-32抗体（兔源性），采用免疫荧光的方法显示、分析评价各实验组大鼠大脑NAc内p-DARPP-32蛋白水平。免疫荧光结果显示:生理盐水对照大鼠脑内NAc区域有少量分散的特异性荧光，强度较弱;吗啡诱导CPP组大鼠脑内NAc区域有多量密集的特异性荧光，强度强;另外两组接受FSS的大鼠脑内NAc区域有中等密度的特异性荧光。应用Image-Pro Plus6.0软件对免疫荧光图片进行统计分析，统计结果表明:多次注射吗啡能够增加伏隔核p-DARPP-32蛋白的表达，多巴胺神经元活性明显增强;与吗啡诱导CPP组大鼠相比较，反复的FSS刺激，能够干扰吗啡诱导伏隔核p-DARPP-32蛋白表达的增加，说明反复FSS能够干预吗啡活化多巴胺神经元功能，进而影响吗啡的致成瘾效应，行为学上最终导致吗啡诱导CPP的建立失败。 综上所述，本研究的结果表明:①FSS能够影响吗啡诱导CPP的形成，并且这种干扰作用不是通过影响实验动物的自发活动来实现的;②存在LHb(GLU)→tVTA(GABA)→VTA(DA)这样的神经解剖学通路;③FSS可能通过激活LHb神经元CaMKⅡ的表达，增强LHb内谷氨酸能神经元的突触传递效能，加强对LHb投射核团tVTA内GABA能神经元的兴奋作用，tVTA内GABA能神经元的兴奋性增加直接导致其对VTA内DA神经元抑制性增强，削弱了吗啡通过与MOR结合后对DA神经元的兴奋作用，进而导致中脑多巴胺投射区域NAc内DA的释放减少，DARPP-32磷酸化水平降低，吗啡的奖赏效应减弱甚至消失，并最终导致吗啡诱导CPP建立的失败，即不能诱导产生CPP。
药物成瘾;条件位置偏爱;吗啡诱导;应激刺激;外侧缰核;腹侧被盖区尾部;多巴胺神经元
第二军医大学
博士
麻醉学
俞卫锋
2015
中文
R749.61;R741.02
94
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）