桑树MaPGIP1基因克隆与表达分析
桑树为多年生木本植物，属于蔷薇目(Rosales)桑科(Moraceae)桑属(Morus L.)桑种(Morusalba L.)。桑树长期以来作为家蚕的饲料树种，是“桑蚕-丝”产业的重要物质基础，但桑树还具有多种用途，如较强的生态学功能以及食用和药用等价值，发展果桑产业在蚕桑资源综合利用方面优势明显，对优化蚕桑产业结构，促进蚕农增收具有重要意义。但果桑产业面临着菌核病的严重威胁，该病是危害桑椹的主要真菌病害，其分布广泛，病势猛，对果桑产业危害极大。 植物细胞壁是抵御病原菌侵染的第一道物理屏障。许多致病真菌能分泌多种水解植物细胞壁的酶类，多聚半乳糖醛酸酶(PG)是真菌分泌的第一个水解酶，被认为是一种重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是普遍存在植物细胞壁的一种糖蛋白，能特异性的识别并抑制真菌PG酶，从而阻止了病原菌对植物的入侵。另外，PGIP对PG的抑制导致植物体内积累有生物活性的寡糖，从而诱发植物抗病响应。PGIP是植物重要的防御蛋白，属于LRR蛋白超家族的一员。本研究从分析川桑基因组信息入手，以重庆市审定的果桑品种‘嘉陵40号’(Morus atropurpureaRoxb.)为材料，从分子生物学角度，研究桑树PGIP基因特征、表达及对烟草的遗传转化。旨为桑树功能基因研究与应用奠定基础，同时为通过转基因技术获得抗真菌病害的植物育种研究提供参考。本研究的结果如下: 1、桑树MaPGIP1基因克隆与生物信息分析 根据川桑基因组数据库预测的PGIP基因设计引物，用嘉陵40号桑作为供试材料，以cDNA为模板，克隆桑树PGIP基因的全长。实验结果是:其CDS序列全长为1017bp，编码338个氨基酸。将该基因序列提交至NCBI，基因登录号为GenBank: KJ704112，并命名为MaPGIP1。在线软件预测MaPGIP1蛋白分子量37.9 kDa，理论等电点为6.65，分子式C1717H2650N442O495S14，酸性氨基酸(Asp+Glu)占9.8％，碱性氨基酸(Lys+Arg)占9.5％，亮氨酸比例最高(13.3％);不稳定系数为38.71，说明该蛋白为稳定蛋白。MaPGIP1的信号肽为N端26个氨基酸残基。MaPGIP1成熟肽氨基酸序列中具有4个潜在的N-糖基化位点，N端和C端各有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基。该基因编码的蛋白质主体结构由9个串联的LRRs基序组成;MaPGIP1氨基酸序列从第76个氨基酸开始的LRRs基序均具有“LxxLxLxxNxLS/TGxIPxxLxxL”（x代表任意氨基酸残基）这样的共有序列。 运用Muscle软件，对获得的MaPGIP1基因进行氨基酸序列的多重比对分析，与已经报道的拟南芥、菜豆和中国李PGIP蛋白的氨基酸序列同源性高达50％-65％，与川桑PGIP氨基酸序列同源性为84％，其序列的差异主要体现在非保守位点上。将获得的桑树MaPGIP1与已报道的其他物种的PGIP蛋白序列构建系统发育树，聚类分析发现，PGIP蛋白的氨基酸序列分成2支，分别为单子叶植物和双子叶植物。MaPGIP1与蔷薇科的中国李和桃等亲缘关系比较近。 2、桑树MaPGIP1基因组织表达分析及对非生物诱导响应 本实验采用实时定量PCR技术研究了MaPGIP1基因在不同组织和桑椹不同发育时期的表达水平以及对非生物的诱导响应。发现该基因在根中的表达量最高，在幼叶中表达量次之，在皮中的表达量最低;另外，该基因在果实发育前中期的表达水平明显高于后期;又分析检测了经水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、损伤以及低温(4℃)处理24h的桑叶片中MaPGIP1基因表达水平。结果表明，SA处理后，MaPGIP1的表达水平显著升高，在处理3h后表达量最高，是未处理的25倍;ABA处理后，MaPGIP1基因表达水平降低到原来的五分之一到六分之一。机械损伤处理后，MaPGIP1表达水平升高，在6h表达量最高，是对照的4.5倍;低温处理后，MaPGIP1基因表达表达水平先下降有上升再下降的趋势，6h基因表达表达水平上调，是对照的1.4倍;24h表达水平是处理前的十分之一。 3、桑树MaPGIP1基因原核表达与功能分析 将MaPGIP1基因亚克隆到原核表达载体pET28a(+)中，成功的构建了重组质粒pET28a-PGIP。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，加入IPTG（终浓度0.5 mmol/L）进行诱导表达。目的蛋白以包涵体的形式存在。采用超声波破碎方法裂解细胞，然后用8mol/L尿素溶解表达产物，通过Ni-NTA柱纯化收集融合蛋白，纯化后的目的蛋白经Western Blot检测，利用含有氧化还原系统的复性缓冲液分步透析复性，最终获得了具有活性的蛋白。 通过对离体的油菜叶片接种果桑肥大性菌核病菌（Ciboria shiraiana）证明MaPGIP1蛋白对该菌的抑制。实验表明MaPGIP1蛋白对该菌在侵染油菜前期有一定的抑制效果，能缓解油菜叶片的感病症状。通过DNS法测定MaPGIP1蛋白对CsPG的抑制效果，结果表明，随着MaPGIP1蛋白量的增加，CsPG将聚半乳糖醛酸裂解成D-半乳糖醛酸的量逐渐减少，这说明该菌对CsPG具有一定的抑制作用，对MaPGIP1蛋白部分性质进行研究，结果发现，在pH4.5-5.0、30℃时，MaPGIP1蛋白的抑制作用最强，能抑制CsPG酶45.5％的活力。
桑树;信息分析;蛋白活性;基因克隆;水解酶
西南大学
硕士
遗传学
余茂德
2015
中文
S888.2
72
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）