Nrf2、Ho-1在糖尿病大鼠视网膜中的表达及tBHQ干预研究
目的：糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病的一种常见微血管并发症，是一种神经血管性疾病，氧化应激学说是DR主要发病机制之一。高血糖或糖尿病(diabetes mellitus，DM)时氧化应激反应将增强并导致视网膜组织损伤。Nrf2/ARE信号通路是非常重要的内源性抗氧化应激通路，当活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）或亲电试剂刺激核因子EF-E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)时，Nrf2转移入核内，识别并结合抗氧化反应元件(antioxidantresponse element，ARE)，启动血红素氧合酶1(heme oxygenase1，HO-1)等下游抗氧化基因蛋白的转录，增强细胞抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，从而保护视网膜。本实验通过采用高脂高糖饮食结合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(strepptozotocin，STZ)的方法制备2型糖尿病大鼠模型，研究叔丁基对苯二酚(tert-butyl hydroquinone，tBHQ)对2型糖尿病大鼠视网膜不同时间节点Nrf2/ARE信号通路表达的影响，探讨tBHQ对视网膜是否具有保护作用及其机制，以期为DR防治提供理论依据。 方法：选取体重在180～200g的4w龄SD雄性大鼠60只，适应性喂养1w后，随机分成正常对照组（NC组，n=20）和造模组(n=40)，NC组给与基础饲料喂养，造模组给予高脂高糖饲料喂养，1月后待造模组大鼠空腹12h之后给与腹腔注射30mg/kg的小剂量STZ建立2型糖尿病大鼠模型（7d后尾部采血测定空腹血糖浓度若大于16.7mmol/L说明建立模型成功），NC组予以相同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射作为对照。造模成功者，随机分成糖尿病组(DM组)、药物干预组(tBHQ组)。tBHQ组于成模后1w使用添加1％ tBHQ的高脂高糖饲料喂养，而NC组、DM组饲养方法不变。tBHQ干预的第4w、第12w末时，检测各组大鼠体重，心脏穿刺采血测定其血糖、血脂水平。取大鼠眼球，部分用于HE染色观察视网膜组织结构的改变及免疫组化检测Nrf-2、HO-1蛋白在视网膜组织中的分布，剩余眼球视网膜组织用于荧光定量PCR检测Nrf-2、HO-1 mRNA在视网膜组织中的表达。 结果:1、35只大鼠成功建立了2型糖尿病大鼠模型，成模率为87.5％。2、一般情况:DM组、tBHQ组大鼠逐渐出现体重减轻、精神萎靡、反应迟钝、多食、多尿、多饮等症状，tBHQ组上述情况较DM组轻，接近于NC组。NC组大鼠体重正常、精神佳、饮食饮水正常。3、生化指标与NC组相比，4w与12w DM组血糖明显升高，差异有统计学意义（t=3.015，2.977，P=0.000，0.000，均P＜0.01）;与NC组相比，4w与12wtBHQ组血糖明显升高，差异有统计学意义(t=5.915，5.018，P=0.000，0.000，均P＜0.01);与12w DM组相比，12w tBHQ组的血糖下降，差异有统计学意义（t=3.415，P=0.002，P＜0.01）;与NC组相比，4w与12w DM组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)升高，差异有统计学意义(FTC=65.641，FTG=63.415，FLDL=61.241，P=0.01，0.01，0.01，均P＜0.05)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL)降低(FHDL=58.317，P=0.02，P＜0.05)。与NC组相比，4w与12w tBHQ组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)升高(FTC=48.810, FTG=51.443, FLDL=53.127, P=0.03,0.02,0.02，均P＜0.05)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL)降低(F=49.312，P=0.03，P＜0.05)。4、组织学变化:HE染色显示，4w NC组大鼠视网膜组织结构清晰，未见明显病理改变;DM组大鼠视网膜细胞排列稍紊乱，内外核层稍融合，出现不同程度细胞水肿的现象;tBHQ组大鼠视网膜细胞排列较整齐，个别细胞可见轻度水肿。12w NC组大鼠视网膜组织HE染色显示视网膜各层结构基本正常，排列基本整齐，余未见明显病理变化;DM组大鼠视网膜组织结构排列疏松，内、外核层排列紊乱，细胞水肿现象明显;tBHQ组大鼠视网膜组织结构较清晰，部分细胞水肿，余未见明显异常。5、免疫组织化学结果:与NC组比较，4w DM组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1蛋白表达增多（tNrf2=3.115，PNrf2=0.002，Nrf2＜0.01;tHO-1=3.485，PHO-1=0.000，PHO-1＜0.01），4w tBHQ组Nrf2、HO-1表达高于4w DM组(tNrf2=2.473,PNrf2=0.031,PNrf2＜0.05;tHO-1=2.785,PHO-1=0.024,PHO-1＜0.05);与NC组比较，12w DM组Nrf2、HO-1蛋白表达增多(tNrf2=3.781, PNrf2=0.000, PNrf2＜0.01;tHO-1=3.785, PHO-1=0.000,PHO-1＜0.01);12w tBHQ组表达高于12w DM组（tNrf2=2.576，PNrf2=0.038，PNrf2＜0.05;tHO-1=2.879，PHO-1=0.018，PHO-1＜0.05）;12w DM组Nrf2表达较4w DM组高，差异有统计学差异（t=0.276，P=0.040，P＜0.05）;12w tBHQ组Nrf2、HO-1表达高于4w tBHQ组，差异有统计学意义（tNrf2=2.516，PNrf2=0.042,PNrf2＜0.05;tHO-1=2.776,PHO-1=0.037,PHO-1＜0.05）。6、荧光定量PCR.与NC组比较，4w DM组Nrf2、HO-1 mRNA表达增多(tNrf2=4.758, PNrf2=0.031,PNrf2＜0.05; tHO-1=5.114, PHO-1=0.029, PHO-1＜0.05);4w tBHQ组表达高于4w DM组（tNrf2=5.133，PNrf2=0.023，PNrf2＜0.05;tHO-1=4.758，PHO-1=0.033，PHO-1＜0.05）;与NC组比较，12w DM组Nrf2、HO-1 mRNA表达增多(tNrf2=4.285，PNrf2=0.041，PNrf2＜0.05;tHO-1=4.514, PHO-1=0.037,PHO-1＜0.05);12w tBHQ组Nrf2、HO-1 mRNA表达高于12w DM组（tNrf2=4.976，PNrf2=0.028，PNrf2＜0.05;tHO-1=4.251，PHO-1=0.039，PHO-1＜0.05）;12w DM组Nrf2 mRNA表达高于4w DM组，差异有统计学意义（t=5.114，P=0.022，P＜0.05）;12wtBHQ组Nrf2、HO-1 mRNA表达高于4w tBHQ组，差异有统计学意义(tNrf2=4.292，PNr2=0.040,PNrf2＜0.05;tHO-1=4.974,PHO-1=0.028,PHO-1＜0.05)。 结论:①tBHQ干预可以有效诱导视网膜组织Nrf2、HO-1的表达，增强视网膜组织抗氧化损伤能力，减轻氧化应激损伤，延缓DR的发展。②tBHQ干预可降低糖尿病大鼠血糖，减轻视网膜组织病理改变，可能成为一种新型视网膜保护剂。
糖尿病性视网膜病变;氧化应激;叔丁基对苯二酚;链脲佐菌素
西南医科大学;四川医科大学
硕士
眼科学
吕红彬
2015
中文
R774.1
62
2015-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）