毕赤酵母表达系统糖基化修饰改造研究
随着蛋白质药物需求量的递增，酵母表达系统逐渐引起人们的关注。基因工程的快速发展，使酵母的人源化改造成为可能。本实验室前期已经通过二次同源重组技术成功敲除毕赤酵母的α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1p)基因，阻断了酵母的高甘露糖基化途径，得到了过度糖基化缺陷株GJK0Ⅰ(OCH(I)-)，然后把酿酒酵母α-1，2-甘露糖苷酶(MnsⅠ)基因内质网定位信号与来自拟南芥的α-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ(α-1，2-mannosidaseⅠ，MDSⅠ)基因融合，定点整合到毕赤酵母基因组上，获得了能够合成哺乳动物MansGlcNAc2复杂型甘露糖型的人源化糖基工程酵母，部分实现了酵母的人源化改造，已用于蛋白质药物的表达。但是酵母表达系统仍然存在一些缺陷，影响了它的推广，这其中就包括糖基工程酵母N-糖基化不完全和过度O-糖基化的问题，我们对此开展了研究。 对于酵母N-糖基化修饰不完全的问题，我们采用导入外源N-糖基转移酶的方式予以改善。利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记，在酵母菌株4-32中转入醇氧化酶启动子(alcohol oxidase promoter，AOX1)控制的利士曼原虫N-糖基转移酶(stauroporine and temperature sensitivity3，STT3)D亚基，构建一株过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母菌株4-32-STT3D。通过SDS-PAGE，Western Blot和N-糖肽酶(peptide-N-asparigine amidase F，PNGase F)酶切等方法，分析其表达的抗HER2抗体(anti-human epidermal growth factor receptor2)的N-糖基化程度。SDS-PAGE结果显示，4-32-HL酵母菌表达的抗HER2抗体除与哺乳动物细胞表达的商业化的抗体有相同的55×103左右的重链主带外，还有一条相对分子质量约为50×103的条带。PNGase F酶切后，上述重链均呈50×103的均一条带，WesternBlot分析证明这些条带均为抗体成分。则50×103的均一条带条带即为未糖基化的抗体重链。而转入STT3D的工程菌4-32-HL-STT3D菌表达的抗HER2抗体则为均一的55×103条带，无未糖基化的50×103条带。用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)作为报告蛋白验证STT3D的作用，SDS-PAGE发现普通糖基工程酵母菌4-32-GMCSF表达的GM-CSF呈现为22×103和20×103的两条带，而转入STT3D后的4-32-GM-CSF-STT3D工程菌表达的则为均一的22×103条带。PNGase F酶切后，这些条带均为相对分子质量约18×103的均一条带。由于GM-CSF有Asn27，Asn37两个N-糖基化位点，所以推测22×103是两个位点均发生了糖基化形成的条带，20×103是仅一个位点发生糖基化形成的条带。 考虑到STT3D表达载体由AOX1甲醇诱导型启动子控制启动，所以我们分别研究了STT3D基因非诱导和STT3D诱导时对酵母生长的影响。统计学分析显示STT3D非诱导时，转入STT3D的4-32-HL-STT3D菌(+STT3D)与未转入STT3D的阴性对照菌4-32-HL(-STT3D)生长情况相比，p=0.032＞0.01，说明两者无显著区别，提示STT3D非诱导时对酵母生长没有影响;STT3D诱导时，p＜0.0001，两者差异性显著，提示STT3D诱导表达对酵母生长影响十分明显。 另一方面对于酵母过度O-糖基化修饰的问题，常规手段是采用敲除的方式阻断基因表达，但是考虑到酵母O-糖基转移酶PMTs对酵母生长是不可或缺的，敲除致死，拟采用可诱导的阻遏方式抑制该过程。根据参考文献报道的CRISPR-Cas9具有的靶向敲除功能，将Cas9突变为dcas9，并由dcas9设计成由诱导型启动子D6控制诱导表达，这样dcas9既保留了与靶位点特异性结合的能力，又失去了核酸内切酶活性，还具有诱导控制PMTs基因启动的特点。为了让dcas9阻遏蛋白进入细胞核发挥作用，我们采用了在dcas9基因的3'端融合核定位信号(nuclear localization sequence，NLS)编码区和在dcas9基因的5'端和3'端均融合NLS编码区两种策略。pmt-gRNA基因由pmt1-gRNA、pmt2-gRNA和pmt4-gRNA基因串联形成，其转录出的pmt1-gRNA、pmt2-gRNA和pmt4-gRNA mRNA分别锚定到pmt1、pmt2和pmt4的转录起始位点上游，由此构建了pGE-D6-dcas9-pmt-gRNA和pGE-D6-NLS-dcas9-pmt-gRNA两种靶向阻遏载体，利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记转入酵母JC307(ura3-，his)菌。再将仅有O-糖基化位点而不具有N-糖基化位点的粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）导入JC307(ura3-，his-)作为报告蛋白，诱导表达后质谱分析两种靶向阻遏载体表达的阻遏蛋白对G-CSF的O-糖基化抑制效果。MALDI-TOF-MS质谱结果显示，无dcas9的阴性对照菌表达的G-CSF两个峰值有9803.2，19612.9两个峰值，仅C端含NLS的dcas9菌株表达的G-CSF有9801.9，19614两个峰值，和阴性组峰值接近，表明该方式融合的CRISPR-dcas9靶向阻遏系统无抑制O-糖基化的作用;而dcas9的两端均有NLS的菌株表达的G-CSF有四个峰值:9645.4，9806.9，19296.3和19620.7，其中9806.9和19620.7与阴性组峰值接近，另外还出现的19296.3峰和19620.7相差324.4，约是两个甘露糖残基的相对分子质量，提示G-CSF O-糖基化程度减弱，说明该方式融合的CRISPR-dcas9靶向阻遏系统发挥了作用，一定程度上抑制了G-CSF的过度O-糖基化修饰。
糖基工程酵母;酵母表达系统;N-糖基化;N-糖基转移酶;甘露糖残基;蛋白质药物
安徽大学
硕士
微生物学
吴军
2015
中文
TQ460.38;TQ926.2
79
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）