两种鸵鸟防御素的鉴定、组织分布及抗菌活性研究
防御素是动物体内广泛存在的一类富含半胱氨酸的抗菌肽，对细菌、真菌、病毒等多种病原微生物均具有抑制作用。防御素抗菌机理独特，不易产生耐受性，是机体抵御外界病原微生物侵袭的重要武器。由于动物防御素具有抗菌谱广、不易产生耐药、安全性高等特点，现已成为抗菌药物研究的热点。研究表明，禽类防御素(AvBD)均属于β-防御素，具备广谱抗菌活性，有开发成抗菌药物的潜力。目前关于禽类防御素的研究较少，仅在鸡、鸭、鹅等常见家禽和少数几种野禽中发现了数十种防御素或防御素基因。在鸵鸟这一古老鸟种也发现有防御素的存在，但关于鸵鸟防御素的基因、组织分布、与其他禽类防御素的进化关系等的研究未见报道，对其抗菌活性和抗菌机理的研究也较少。本研究以此为切入点，采用分子克隆、免疫组织化学方法和细菌学技术等综合手段，对鸵鸟防御素AvBD2和AvBD7的基因序列、进化关系、组织分布和抗菌活性等进行研究，旨在为鸵鸟防御素的分子生物学研究和开发利用提供理论依据。主要研究内容与结果如下: 1、鸵鸟防御素基因的克隆与序列分析参考GenBank中公布的其他禽类防御素的基因序列设计引物，以鸵鸟骨髓总RNA为模板，通过RT-PCR扩增到2个鸵鸟防御素基因的cDNA。cDNA序列测定后，用MEGA5.05软件和Codon W软件对基因序列进行同源性分析、进化树分析和密码子偏好分析。结果表明:所扩增到两个鸵鸟防御素分别是鸵鸟AvBD2和AvBD7，其中鸵鸟AvBD2 cDNA全长195bp，编码64个氨基酸;鸵鸟AvBD7 cDNA全长201bp，编码66个氨基酸;同源性分析发现，鸵鸟AvBD2与鹅AvBD2的同源性最高，达86％，其次是鸡AvBD2(83％)、鸭AvBD2(83％)和火鸡AvBD2(81％);鸵鸟AvBD7与鸡AvBD7和鸭AvBD7的同源性最高，均达到81％，与鸡、鸭、鹅的AvBD6基因也有75％的同源性;进化树分析显示两鸵鸟防御素与禽类的同类防御素亲缘关系最近;密码子偏好性分析发现，两种鸵鸟防御素具有与家禽同类防御素所不同的密码子偏好;两种鸵鸟防御素前体均由信号肽、前片段和成熟肽3部分构成;两种鸵鸟防御素具有其他禽类防御素的一些共同特征，例如分子内都含有6个保守的半胱氨酸和“GXC”模体。这些结果为禽类防御素的进化研究以及分子生物学研究提供了参考。 2、鸵鸟防御素的表达与抗体制备按照大肠杆菌的密码子使用偏好，用密码子优化软件（Codon Adaptation Tool）对两种鸵鸟防御素基因的编码区(CDS)进行了密码子优化，人工合成优化后的基因片段。将合成的基因片段插入原核表达质粒PGEX-KG中构建重组表达质粒，并转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。提取表达的重组蛋白，免疫Balb/C小鼠制备抗血清。结果显示:人工合成的鸵鸟AvBD2和AvBD7基因在大肠杆菌中成功表达，其中鸵鸟AvBD2的表达量较大;两种表达蛋白均以包涵体的形式存在，分子量大小约33.5 KD，与预期结果相符;用ELISA法检测免疫后的小鼠血清抗体，效价可达到1∶10240。鸵鸟防御素的成功表达以及抗体的制备为其生物学功能研究提供了帮助。 3、鸵鸟防御素的组织分布研究采用RT-PCR和real-time PCR技术分析了两种鸵鸟防御素在18种组织中的mRNA表达情况;以制备的鸵鸟防御素多克隆抗体为一抗，用免疫组化法分析了两种鸵鸟防御素在脾、胸腺、法氏囊、骨髓4种免疫器官中的阳性信号分布。结果显示:两种鸵鸟防御素广泛分布于不同组织中，但在不同组织中的表达量有差异;鸵鸟AvBD2在骨髓、法氏囊、睾丸、脾脏等组织中表达量较大，在食管、肌胃、胰、卵巢等处表达量较小;鸵鸟AvBD7在骨髓、法氏囊、睾丸、肺等组织中表达量较大，在肌胃、腺胃、胰、肝、卵巢等处表达量较小;免疫组化分析显示，两种鸵鸟防御素的阳性信号在4种鸵鸟免疫器官中广泛分布，其中以法氏囊小结的皮质部以及骨髓组织中的阳性信号最多。鸵鸟防御素组织分布的差异可能提示其在不同组织中所发挥的主要功能不同。 4、鸵鸟防御素的抗菌活性研究根据推导出的鸵鸟防御素的氨基酸序列，人工合成了鸵鸟防御素AvBD2和AvBD7的成熟肽，并用菌落计数法验证了这两种防御素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、巴氏杆菌和无乳链球菌的抗菌活性，以及盐离子浓度、温度等对抗菌活性的影响。结果显示，两种鸵鸟防御素对6种细菌具有良好的抑制效果，当其浓度达到25μg/mL时抑菌率达到60％，浓度达到100μg/mL时抑菌率可达90％以上;两种鸵鸟防御素对盐离子浓度敏感，当溶液中氯化钠浓度达到150mM时，抑菌效果大幅下降。在温度为-20℃～60℃或pH值为3～10的环境中处理30min，两种鸵鸟防御素的抗菌活性未发生明显变化。这些结果为进一步研究鸵鸟防御素的抗菌机理以及鸵鸟防御素的开发利用奠定了基础。
鸵鸟;防御素;防御素基因;组织分布;抗菌活性;进化关系
华中农业大学
博士
基础兽医学
彭克美
2015
中文
Q959.711;Q524.2
104
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）