Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防卸功能的遗传学分析
许多细菌和大多数的古菌基因组均编码称作CRISPR-Cas(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated)的获得性免疫系统来抵御病毒或质粒的侵害。CRISPR-Cas系统被分为3个主要类型，Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，又被进一步划分为11个亚型。Sulfolobus islandics Rey15A编码一个Ⅰ-A亚型(Cascade)和两个Ⅲ-B亚型（Cmr-α和Cmr-β）CRISPR-Cas干涉系统，本研究项目开始以前，这些系统中的cas基因的功能未被解析，而且，当时已研究过的Cmr系统被证实在体外切割RNA，但它们的体内RNA切割活性并未被证实。本研究的以S.islandicus Rey15A为研究材料，解析了Ⅰ-A亚型系统中每个Cas蛋白在CRISPR介导的DNA干涉中的功能，另外，明确地证实了Cmr系统的体内RNA干涉活性。 为了分析S.islandicus Rey5AⅠ-A亚型系统中单个cas基因在入侵物免疫过程中的功能，我们构建了S.islandicus Rey5AⅠ-A亚型系统中单个cas基因以及除Ⅰ-A亚型系统外的其它几个cas基因座的缺失株。对每个缺失株在pre-crRNA加工及质粒干涉方面的表型进行分析后，结果说明，Cas7，Cas5，Cas6和Cas3为Ⅰ-A亚型系统介导的DNA干涉所必需的蛋白成分，然而，Csa5及其它几个CRISPR-Cas系统均不参与此过程。Cas6被证实为此菌株中唯一一个负责pre-crRNA加工的酶，同时Cas7，Cas5和Cas3也介入此过程。Cas7和Cas5分别稳定pre-crRNA加工中间产物和成熟crRNA;缺少Cas3后加工中间产物大量积累，但其中涉及的原理目前未知。 S.islandicus Rey15A Cmr系统介导的的体内RNA干涉活性的确定是通过构建一个RNA干涉试验来实现的。RNA干涉试验的原理是在质粒上表达一个人工CRISPR（artificial CRISPR;所得到质粒称为pAC质粒），该人工CRISPR含有一个来源于β-糖苷酶编码基因lacS的spacer，因此，从pAC上表达出来的crRNA能够介导内源CRISPR-Cmr系统对lacS信使RNA进行干涉，而干涉效果可以通过检测pAC转化子细胞提取物中残留的β-糖苷酶活性来进行评估。在不同的Cmr基因座缺失株中检测RNA干涉活性结果显示，只有两个Cmr基因座均缺失的突变株失去了RNA干涉能力，说明每个Cmr系统均参与了体内RNA干涉。在spacer的不同位点引入突变并用来构建pAC质粒，通过检测这些突变对RNA干涉活性的影响，一个位于crRNA3'端的3nt长的序列被确定为对RNA干涉活性至关重要。对pAC转化子中未被切割的lacS信使RNA的量用实时定量PCR进行评估的结果进一步证实了Cmr介导的体内RNA切割活性。3'-RACE结果显示，lacS信使RNA中的剪切位点被定位在S1 protospacer序列内，结果还表明，Cmr-α利用尺标原理在测定的（间隔6nt）位点对RNA进行切割，而Cmr-β则利用序列特异性原理在类似UA(UA，UG或UU)位点切割protospacer RNA。
冰岛硫化叶菌;遗传分析;基因功能;病毒防卸
华中农业大学
博士
微生物学
佘群新
2015
中文
Q75
104
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）