耐冷及耐盐酯酶的基因克隆、蛋白表达、酶学性质及突变研究
酯酶是一类催化短链酰基酯水解的酶，它能催化酯化反应、转酯反应和相互酯化反应等多种反应类型，且酯酶的催化反应具有很高的对映选择性、区域选择性和立体选择性。与嗜热和嗜中温酯酶相比，冷活性酯酶具有低温下催化效率高且热不稳定等特性，它能节省能源，可被用于热不稳定化合物的合成，是近年来生物催化领域的研究热点之一。酯酶是一类通用的生物催化剂，被广泛应用于食品工业、医药工业、去污剂工业和生物柴油工业等行业。 本研究从沙雷氏菌Serratia sp.中克隆了一个酯酶基因estS，将其在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行了异源表达和纯化，并对其酶学性质和动力学进行了研究。针对EstS的热稳定性差的问题，利用随机突变技术对其进行了分子定向改造。本研究中取得成果如下: 酯酶基因estS全长909 bp，编码302个氨基酸，蛋白分子量约为32.5 KDa，pI为5.05，通过SignlP4.1预测未发现信号肽序列。酯酶EstS的最适底物为2碳侧链底物对硝基苯基乙酸酯(p-nitrophenyl acetate)，对16碳的对硝基苯基棕榈酸酯(p-nitrophenyl palmitate)几乎没有活性。EstS的最适反应温度为10℃，在0℃时仍保留约92％的酶活性，表明EstS是一个冷活性酯酶。EstS在50℃以上变得不稳定，55℃温育20分钟后几乎检测不到活性。热变性实验表明酯酶EstS的T1/2在50℃温育条件下为50 min，并且温育1h后残留41.23％的酶活性。EstS最适pH为8.5，在pH5.5-9.5范围内比较稳定。同时，EstS具有很好的耐盐特性，在5MNaCl存在情况下，仍保留高达95％的酶活性，而且经4 M NaCl在4℃下处理24小时，仍保留80％的活性。1 mmol/L的Mg2+、Ba2+和Mn2+对EstS的活性有轻微的激活作用，同浓度的Zn2+和Cu2+对EstS的活性有轻微的抑制作用。EstS对丝氨酸蛋白抑制剂PMSF不敏感，但10％的乙腈、正丁醇和SDS能即完全抑制它的活性。以对硝基苯基乙酸酯为底物时，EstS测得的动力学常数Km为74.02μM，Vmax为7.351μM·min-1，Kcat为2.339×103 s-1,Kcat/Km为31.60 s-1·μM-1。 为了探讨EstS的热稳定性，利用易错PCR技术构建了随机突变文库，将诱导后的突变子细胞用T7噬菌体裂解，再将细胞裂解液在50℃中处理40 min后，按照酯酶活性测定方法进行筛选。本研究从约8000个突变子中筛选到一个突变体1-D5，氨基酸序列比对显示，1-D5有3个氨基酸发生了改变(A43V，R116W,D147N)。突变酶1-D5在30℃时保留88.24％的活性，比野生型高约10％。在50℃温育条件下，1-D5的T1/2值达到70 min，并且温育1h后残留63.29％的酶活性，比野生型高约22％，表明1-D5的热稳定性有所提高。1-D5以对硝基苯基乙酸酯为底物的Km，Kcat和Kcat/Km分别为87.59μM，2.501×103 s-1和28.55 s-1·μM-1。
沙雷氏菌;酯酶;冷活性;热稳定性;基因克隆;蛋白表达;生物催化剂
华中农业大学
硕士
微生物学
刘子铎
2015
中文
Q814.9
73
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）