糙皮侧耳2-Cys Prx基因功能的研究
糙皮侧耳除了富含氨基酸和维生素外，还含有适量的碳水化合物和矿物质，具有药用性能，生态价值和经济价值。氧化应激对易受外界环境胁迫的糙皮侧耳会产生不利的影响，因此，它已经进化出一系列抗氧化机制来清除活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)。2型半胱氨酸过氧化物酶（2-Cysteine peroxiredoxin，2-Cys Prx）是一种过氧化物酶，能够清除过氧化物，保护细胞免受氧化应激。本研究主要利用超表达和沉默技术对糙皮侧耳2-Cys Prx基因功能进行初步研究，结果如下: 1、2-Cys Prx基因开放式阅读框为929 bp，包含5个内含子，6个外显子。其中cDNA序列全长651 bp，编码了216个氨基酸。预测的分子量大小和理论等电点分别为23.9 kDa和5.4。预测的氨基酸序列具有典型的2-Cys Prx结构特点，含有两个保守的半胱氨酸结构域（Cys48和Cys170）以及GGLG(Gly-Gly-Leu-Gly)和YF(Tyr-Phe)两个保守的模体，这两个模体能灵敏地识别H2O2并进行信号传导。在进化关系上糙皮侧耳的2-Cys Prx基因与双孢蘑菇距离最近。 2、构建了2-Cys Prx基因的超表达载体pCAMBIA1302-OE以及沉默载体pCAMBIA1302-RNAi-1和pCAMBIA1302-RNAi-2，并通过根癌农杆菌介导转化糙皮侧耳菌丝体，经过PCR验证和绿色荧光蛋白的检测表明目的基因已经稳定插入糙皮侧耳的基因组中，共获得23个超表达转化子，28个沉默转化子R1，18个沉默转化子R2，转化效率分别是62％、67％和60％。通过qRT-PCR分析2-Cys Prx基因在不同的转化子中表达水平，结果表明与野生型菌株相比，超表达转化子中2-Cys Prx基因的最高表达量可达3.5倍。沉默转化子R1干扰效率58％，而R2干扰效率为34％。 3、研究发现，超表达或沉默2-Cys Prx基因对糙皮侧耳的菌丝和菌落形态均无明显影响，非生物逆境胁迫试验显示，2-Cys Prx基因的超表达提高了糙皮侧耳抗高浓度H2O2、抗高温和抗高渗透压的能力。而2-Cys Prx基因的沉默会降低对非生物逆境胁迫的敏感性。这表明2-Cys Prx基因可能是胁迫应答信号转导途径的调节器。 本研究初步证实了糙皮侧耳2-Cys Prx基因具有保护细胞内蛋白免受氧化损伤的功能。
糙皮侧耳;基因功能;非生物逆境胁迫;氧化损伤
华中农业大学
硕士
微生物学
马爱民
2015
中文
S646.141
86
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）