sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究
肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TNF-related apoptosis inducingligand，TRAIL）是TNF超家族中新发现的一员，是人体内正常表达的一种蛋白分子。TRAIL蛋白能特异的与某些肿瘤细胞表面的凋亡受体结合，从而诱导肿瘤细胞凋亡，且不诱导正常细胞和组织凋亡，也不像已发现的细胞凋亡因子TNF-α会产生严重的炎症反应。TRAIL蛋白这一关键特性的发现，使其成为目前肿瘤治疗研究中的热点。完整的TRAIL蛋白含有281个氨基酸残基，但其完整的蛋白分子在原核细胞中可溶性低，限制了其的应用。但TRAIL蛋白分子的114-281位氨基酸片段（soluble TRAIL，sTRAIL）在原核表达中的可溶性大大提高，且保持了活性。利用微生物作为宿主表达抗肿瘤外源蛋白，原因在于大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、表达量较高，利于发酵制备物的提取、纯化、控制等优点，研究工作日益受到重视。 本研究通过培养人早幼粒白细胞HL-60细胞，提取总RNA，通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段，构建了重组质粒pET28a-sTrail。鉴定成功以及测序正确后电击转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导成功表达sTRAIL蛋白。经过对诱导温度，诱导转速以及IPTG浓度的优化，确定了在16℃、IPTG浓度为0.1mM、诱导时间12h的诱导条件下可溶蛋白含量最高。通过优化Ni-IDA层析柱纯化重组蛋白条件，SDS-PAGE蛋白电泳以及胶内酶解质谱鉴定，确定纯化收集的蛋白为sTRAIL蛋白。纯化后的sTRAIL蛋白对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人子宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人结肠癌细胞(HCT-116)和人大细胞肺癌细胞(H460)等肿瘤细胞有良好的抑制效果，通过MTT法检测，在sTRAIL蛋白浓度为1200 ng/mL，作用48h后，对上述细胞的抑制率分别为32.9％、27.2％、29.7％、22.5％和10.8％，存在浓度依赖性。从倒置相差显微镜观察发现，越来越多的肿瘤细胞从梭形或不规则形态转变为圆形，且细胞变厚，透光率发生变化。同时sTRAIL蛋白对正常的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)未发现细胞毒性。 本研究对sTrail重组基因的克隆，sTRAIL蛋白表达、纯化以及抗肿瘤活性进行了研究。sTRAIL蛋白所具有良好的抗肿瘤生物活性，且对正常细胞无害，有望成为新型的能在临床抗肿瘤的药物分子。本研究也为今后的科研工作提供了新的实验依据。
肿瘤坏死因子相关凋亡配体;基因克隆;原核表达;蛋白纯化;抗肿瘤活性
湖南师范大学
硕士
微生物学
张友明
2015
中文
R73-36
55
2015-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）