脊髓PPARα对肥胖大鼠外周炎症及炎性痛觉过敏作用和机理的研究
研究背景: 大量的肥胖动物模型研究表明肥胖可增加机体对疼痛的敏感性。过氧物酶体增殖体激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors;PPARs)作为重要的配体激活转录因子，属于核受体超家族。目前研究有三种不同的异构体，分别是PPARα，PPARβ/δ，PPARγ。它们均在细胞分化、增殖及脂质代谢等生理过程中扮演着重要的角色。PPARα对于炎症反应的调节至关重要，目前研究其在中枢神经系统包括大脑、脊髓和背根神经节等均有表达。最近的研究表明，在正常动物，中枢系统PPARα参与了外围炎症和炎性痛觉过敏。然而，在肥胖动物模型，在外围组织包括脂肪和肌肉其PPARα的表达却明显降低。这些结果让我们猜测到肥胖可能引起中枢水平PPARα的表达异常，并进而影响周围炎症反应和炎性痛觉过敏。这也许是肥胖增加疼痛敏感性的一个重要的分子机制。 脊髓是疼痛感知的重要的中继站，愈来愈多的脊髓水平的研究证实，外周炎症及组织损伤通过各种递质及通路可以引起脊髓水平相关功能分子蛋白或基因发生一系列的变化，此种变化可导致脊髓伤害性神经元的持续兴奋性增强，形成所谓的中枢敏化现象，同时脊髓也可以通过信号传递及时反馈调节外周感知和炎症。核因子-κ B(Nuclear factor-kappa B，NF-κ B)是一种重要的炎症相关性转录因子，在中枢神经系统中起到重要作用。包括炎症、突触传递、学习、记忆和疼痛等在内的许多生理活动或病理过程，都有核因子-κB参与。NF-κB参与生理及病理活动是通过调控其下游的众多因子来实现，这些因子包括细胞因子(IL-1β、 TNF-α)，促炎症酶COX-2和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)等。可见上述信号通路在疼痛的形成和维持中扮演着重要角色。 因此，本研究通过建立肥胖大鼠模型，探讨肥胖情况下模型大鼠脊髓水平PPARα表达情况;同时采用注射角叉菜胶诱导急性炎症模型，通过检测脊髓水平PPARα及NF-κB、IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS的表达，进一步明确其在外围炎症和炎性痛觉过敏中可能作用及其分子机制，为治疗疼痛提供新的可能作用靶点。本文主要从以下几部分展开论述: 第一部分 肥胖大鼠脊髓PPARα及炎性因子表达的研究 目的: 建立肥胖大鼠动物模型，探讨PPARα及炎性因子在肥胖大鼠脊髓水平中的表达和活性，以阐明肥胖是否能够引起脊髓水平PPARα的表达异常，并检测肥胖大鼠脊髓水平部分炎性因子的表达情况。 方法 1.肥胖大鼠动物模型的建立，SD雄性大鼠随机分为两组（HF与LF组），分别给予高脂肪食物(45％ kcal as fat;Research Diets，New Brunswick，NJ，USA)和低脂肪食物(10％ kcal as fat;Research Diets，New Brunswick，NJ，USA)作为日常饮食，饲养12周。 2.大鼠饲养至第10周时，经侧脑室(ICV)注射不同剂量(0.1，0.5 and1.0μg/h)的PEA，通过渗透压微泵技术注射aCSF为对照，注射周期为2周。 3.采用Western blot技术、免疫荧光染色技术检测脊髓PPARα表达水平，Western blot技术测定炎性因子（IL-1β，TNF-α，COX-2，iNOS）蛋白水平，转录因子试剂盒检测PPARα，PPARβ，PPARγ的表达水平。 4.临床分析仪测定血浆中葡萄糖、胆固醇及甘油三酯含量，胰岛素、瘦蛋白及脂联素由ELISA试剂检测。 结果: 1.分组喂养4周后，相比于LF组，HF组表现出明显的体重增加趋势，至12周体重变化更为明显(P＜0.05)。HF组大鼠的血浆胰岛素、瘦蛋白及胆固醇含量升高(P＜0.05)，脂联素含量明显降低(P＜0.05)，血浆中葡萄糖及甘油三酯含量并未发生明显变化(P＞0.05)。 2.大鼠喂养8周时，HF组大鼠脊髓中PPARα表达量开始低于LF组，在第12周时，HF组PPARα表达量、表达活性相比于LF组有更加明显的降低(P＜0.05)。肥胖大鼠ICV注射1.0μg/h PEA，PPARα表达量与表达活性在肥胖大鼠中达到了对照组（LF组）的同等水平;经过注射aCSF后，PPARα表达量与表达活性仍旧维持在HF组注射前水平(P＞0.05)。 3.荧光免疫检测发现HF与LF两组的脊髓灰白质中PPARα均有表达，HF组中PPARα的表达较LF组显著降低（P＜0.05）。 4.炎性因子的检测结果示HF与LF组IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS都没有显著差异(P＞0.05);当ICV注射PEA和aCSF后，两组的炎性因子表达同样没有差异(P＞0.05)。 结论: 高脂饮食成功构建肥胖大鼠模型;肥胖大鼠脊髓PPARα表达及活性明显降低。而炎性因子IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS并无明显变化。肥胖大鼠ICV注射1.0μg/h PEA，能够使得PPAR u表达量及活性恢复到正常水平。 第二部分 肥胖大鼠脊髓水平PPARα下调与外周炎症和炎性痛觉过敏增强关系的研究 目的: 利用注射角叉菜胶建立炎性疼痛模型，研究PPARα的异常表达与周围炎症反应和炎性痛觉过敏的关系，利用siRNA载体对PPARα基因进行沉默，探讨PPARα异常表达与周围炎症反应和炎性痛觉过敏的分子机理。 方法: 1.建立肥胖大鼠动物模型，SD雄性大鼠随机分为两组（HF组与LF组），分别给予高脂肪食物(45％)、低脂肪食物(10％)作为日常饮食，饲养12周。 2.10周时经侧脑室(ICV)注射1.0μg/h的PEA，通过渗透压微泵技术注射aCSF为对照，注射周期为2周;大鼠右后爪足底皮下注射50μl的3％角叉菜胶(CAR)。 3.CAR注射前1h及注射后第2h、4h、6h、8h以及24 h，用von Frey以up-down法推算大鼠的机械痛阈值，按照Hargreaves法测定大鼠的热痛阈值，用足趾容积测量仪检测大鼠右侧足趾肿胀程度。 4.ICV注射PEA的HF组大鼠经麻醉后，微量注射器分别吸取10μl PPARαsiRNA及阴性对照，针头由椎间孔插入蛛网膜下区域进行注射，根据大鼠的甩足或甩尾反应确定针头是否插入正确位置，注射完毕后，火鼠放回笼了饲养。 5.采用Western blot技术检测脊髓中PPARα、NF-κB p65、炎症因子及IκBα表达水平，转录因子分析试剂盒检测PPARα、NF-κ B p65 DNA结合活性。 6.采用单因素回归分析进行PPARα与足肿胀容积、机械痛阈值及热痛阈值的相关性分析。 结果: 1.注射角叉菜胶后，两组大鼠都出现了热痛觉过敏、机械性触诱发痛和足肿胀反应。HF组大鼠在第2小时开始出现热痛觉过敏、机械性痛觉过敏与足肿胀，明显早于LF组大鼠，在注射后4小时时，热痛觉过敏与机械性痛觉过敏达到最大值(P＜0.05)，在注射后2-24小时内，HF组大鼠存在更加明显的足肿胀程度(P＜0.05);ICV注射1.0μg/h PEA后，HF组大鼠热痛觉过敏、机械性痛觉过敏与足肿胀反应明显减弱，与LF组大鼠比较差异无统计学意义((P＞0.05)。 2.注射角叉菜胶6h后，HF与LF组大鼠，IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS的表达量都有非常显著的上升，HF组大鼠增加幅度更明显(P＜0.05);对HF组大鼠给予PEA注射后，IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS表达量明显下降，与LF组大鼠比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 3.经注射角叉菜胶6h后，HF组、LF组的IκBα蛋白表达量呈现明显下降趋势，HF组的下降程度更加明显（P＜0.05）。HF组经注射PEA后，IκBα蛋白表达量呈现上升恢复趋势;HF组、LF组的NF-κB p65蛋白表达量呈现明显上升趋势，HF组的上升程度更加明显(P＜0.05)。HF组经注射PEA后，NF-κB p65蛋白表达量与活性呈现下降趋势，与LF组大鼠比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 4.注射角叉菜胶6h后测定的PPARα表达量与大鼠在4h时的热痛阈成正相关关系(P＜0.01)，与机械痛阈无相关关系(P=0.07)，而与足肿胀成负相关关系（P＜0.01）。 5.PPARα siRNA能够使得PPARα蛋白的表达明显下调，脊髓中PPARα基因沉默后，ICV注射PEA对热痛觉过敏、机械性痛觉过敏和足趾肿胀度均恢复到了HF组水平。 结论: 在肥胖大鼠炎性疼痛模型中，PPARα蛋白的表达及活性下调，该蛋白的下调使得脊髓中炎症因子上调，使得外周炎症更加敏感，造成了肥胖模型中外周炎症及痛觉过敏反应的增强;同时肥胖引起的中枢神经系统的PPARα蛋白表达及活性的下调，可以作为治疗肥胖相关的疼痛综合征的新靶点。
外周炎症;炎性痛觉过敏;病理机制;脊髓过氧物酶体增殖体激活受体;肥胖症
山东大学
博士
麻醉学
傅志俭
2015
中文
R745;R741.02
150
2015-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）