CUL4B通过抑制p53-ROS正反馈环减缓压力诱导的细胞衰老
p53是重要的抑癌基因，50％以上的人类肿瘤中该基因存在突变，并且纯合敲除p53的小鼠可自发多种肿瘤。该基因编码的蛋白半衰期很短，使该蛋白维持较低的表达水平，多种压力刺激均可激活p53，使该蛋白半衰期延长。活性氧(ROS)是细胞有氧代谢所产生的一类含氧化合物的总称，包括羟自由基(.OH)、超氧阴离子(O2.-)、过氧化氢(H2O2)以及其他多种过氧化物。ROS可作为细胞信号传导的第二信使，参与调控多种细胞生理过程。 抑癌基因p53可以调控ROS水平。生理条件或短暂轻度的压力刺激下，p53可缓解氧化压力发挥抗氧化作用，而较强和持续的压力刺激下p53将加剧氧化压力发挥促氧化作用。p53发挥抗氧化或是促氧化作用的机制主要是通过调控其下游氧化还原相关基因。CDKN lA，PIG3，PUMA，BAX，GPX1等一系列p53靶基因均可在一定压力刺激下调控细胞内ROS水平。 E3泛素连接酶复合物的骨架蛋白CUL4B在多种生物进程中发挥关键调控作用，包括细胞周期，DNA复制和基因转录。CUL4B在多种肿瘤中表达上调并具有明显的促癌作用。但其对细胞衰老的影响尚不清楚。强烈压力刺激后衰老和凋亡是细胞的两种重要命运走向。而这种走向在不同的细胞中往往存在倾向性，例如宫颈癌细胞HeLa，人类肾上皮细胞HEK293等往往容易走向凋亡而人类成骨肉瘤细胞U2OS和正常人类成纤维细胞NHF则更容易走向衰老。为了探讨CUL4B在细胞衰老中发挥的作用，我们利用人类成骨肉瘤细胞U2OS和正常人类成纤维细胞NHF进行了实验研究。结果表明CUL4B在压力诱导的早衰细胞中存在蛋白水平的显著下调并且这种下调促进压力诱导的细胞衰老进程。 p53可调控细胞活性氧水平，而细胞内活性氧水平的改变同样可影响p53的激活，提示细胞内可能存在p53-ROS反馈环。较强或持续压力刺激下p53发挥促氧化作用，p53激活后可通过影响CDKN lA，PIG3等一些促氧化基因上调细胞内活性氧水平;同时细胞内ROS水平的升高可通过激活ATM进一步激活p53通路。此时细胞内存在强大的p53-ROS正反馈环，持续的信号反馈激活后最终引起压力诱导的细胞衰老或细胞凋亡。我们发现在我们的研究体系中p53-ROS正反馈环调控压力诱导的细胞衰老，而CUL4B正是通过抑制这一正反馈环的信号激活减缓了压力诱导的细胞衰老。 我们发现氧化压力刺激后CUL4B能促进p53泛素化，进而促进了p53的蛋白降解过程。氧化压力刺激后，CUL4B缺失将引起p53半衰期的延长而CUL4B过表达则引起p53半衰期的缩短，并且我们在NHF细胞中检测到CUL4B蛋白与p53蛋白的直接结合，进一步的泛素化实验也显示压力刺激下CUL4B能促进p53的泛素化。 综上所述，我们的结果表明压力刺激后CUL4B蛋白表达量显著下调，这种下调抑制了p53的泛素化降解从而延长了p53的半衰期，进而造成了p53-ROS正反馈环的持续激活，最终抑制细胞增殖促进压力诱导的细胞衰老;CUL4B过表达后，经压力刺激时p53泛素化降解加快半衰期缩短，从而显著抑制p53-ROS正反馈环的激活，进而促进细胞增殖减缓压力诱导的细胞衰老。我们的研究推进了对p53在压力诱导细胞衰老过程中的作用以及其上游调控机制的认识。 第一部分 CUL4B在压力诱导的早衰细胞中表达下调 Cullin家族是目前已知最大的一类E3泛素连接酶，其中CUL4B是该家族的重要成员。CUL4B在多种表观修饰和生物学进程中发挥重要作用。该基因在多种肿瘤组织中过表达并促进肿瘤细胞恶性程度，而CUL4B低表达的肿瘤细胞则表现为增殖减缓，细胞恶性程度降低。此外，CUL4B在表观调控方面抑制了一些衰老相关基因的表达，例如p16和CXCR2，由此我们推测CUL4B在细胞衰老过程中可能发挥作用。为此，我们首先检测了CUL4B在多种类型衰老细胞中的表达变化情况。结果表明CUL4B在压力诱导的早衰细胞（电离辐射，H2O2或羟基脲诱导的早衰细胞）中蛋白表达水平下调而在端粒缩短引起的复制衰老细胞中蛋白表达水平不变。并且我们进一步在小鼠耳朵成纤维细胞(MSF)中检测了CUL4B的蛋白表达情况，结果表明这种经受较强氧化压力的小鼠细胞衰老后CUL4B的蛋白表达水平同样显著下调。值得一提的是压力诱导早衰细胞中CUL4B蛋白水平的下调并没有伴随转录水平的改变，因此CUL4B的蛋白表达下调不是由于转录水平下调引起的，这种蛋白水平的显著下调可能是通过蛋白降解或microRNA的调控实现的。 第二部分 CUL4B抑制压力诱导的细胞早衰 伴随细胞衰老会有一系列基因表达水平的改变，这些改变可能是衰老发生的一部分原因也可能是衰老发生后的一种结果。通过第一部分结果我们发现压力诱导细胞早衰后CUL4B蛋白水平显著下调，但我们并不清楚这种下调是细胞衰老的原因还是结果。为了解开这一疑惑，我们构建了CUL4B低表达和过表达的细胞系，并利用这些细胞系进行了一系列的压力刺激后早衰情况的检测。结果表明压力刺激后CUL4B低表达细胞的衰老染色阳性比例显著升高而BrdU掺入比例显著降低;与此相对应的是CUL4B过表达细胞的衰老染色阳性比例显著降低而BrdU掺入比例显著升高，即CUL4B低表达显著促进细胞早衰而CUL4B过表达则显著减缓细胞早衰。与以上结果相对应的是CUL4B在复制衰老中不存在蛋白水平的显著下调，其表达水平的改变也不会影响复制衰老。此外，Cul4b敲除小鼠的耳朵成纤维细胞相对于野生型小鼠的耳朵成纤维细胞在氧化压力下更容易衰老。而CUL4B转基因小鼠的耳朵成纤维细胞相对于对照细胞对细胞早衰有显著的抵抗作用。并且CUL4B表达情况的改变不影响压力诱导的细胞凋亡。综上所述，CUL4B表达水平显著影响压力诱导的细胞衰老进程。 第三部分 CUL4B对p53-ROS正反馈环的负调控 抑癌基因p53是细胞内重要的转录因子，压力刺激后p53可被磷酸化激活，这种活性状态的p53进入细胞核并结合到靶基因的启动子处调控基因的转录活性。其下游靶基因中包含大量的抗氧化及促氧化相关基因。较为缓和的压力刺激下，p53可通过下游抗氧化基因发挥抗氧化作用;而强烈压力刺激下p53通常通过下游促氧化基因发挥促氧化作用。p53野生细胞受MDM2拮抗剂Nutlin-3处理后细胞ROS水平显著升高，而p53缺失后这一升高现象被完全抑制。这一现象表明p53可通过调控这些氧化还原相关基因的表达而调控ROS的水平。活性氧(ROS)是细胞正常代谢的一种产物，细胞维持一定水平的ROS也是维持细胞增殖所必须的，但是过高水平的ROS会引起细胞强烈的应激反应并使细胞走向衰老或凋亡。ROS可通过激活ATM而进一步激活p53通路，因此细胞内存在p53-ROS反馈环。强烈压力刺激下，p53-ROS正反馈环会使信号持续激活从而促进细胞衰老或凋亡。为了探究CUL4B抑制细胞早衰的调控机制，我们用双氧水和Nutlin-3分别处理CUL4B低表达及过表达的细胞48小时，之后对细胞的ROS水平及p53的激活水平进行检测。结果显示压力刺激后CUL4B低表达细胞活性氧水平及p53激活情况显著高于对照细胞;而CUL4B过表达细胞活性氧水平及p53激活情况均受到一定程度的抑制。我们由此推测CUL4B低表达强化了p53-ROS正反馈环，而CUL4B过表达抑制了这一反馈环。我们进一步证实CUL4B对细胞早衰的调控依赖于p53-ROS正反馈环。活性氧清除剂N-乙酰基半胱氨酸(NAC)的拯救实验结果表明CUL4B缺失促进的早衰以及p53的过度激活依赖于细胞内过量产生的ROS。而同时干扰CUL4B和p53后CUL4B低表达引起的过度早衰被完全逆转，这一拯救实验也进一步表明CUL4B缺失对细胞早衰的促进依赖于p53。综上所述，CUL4B缺失后持续激活的p53-ROS正反馈环促进了细胞早衰，而CUL4B过表达则通过抑制p53-ROS正反馈环减缓压力诱导的细胞早衰。 第四部分 CUL4B促进p53的泛素化及蛋白降解 CUL4A与CUL4B存在大量的同源序列，因此在细胞功能上经常发挥类似作用。已有文献报导CUL4A可促进p53的泛素化降解，所以接下来我们检测了CUL4B对p53泛素化的影响。我们发现压力刺激后CUL4B能促进p53泛素化并促进p53的蛋白降解。氧化压力刺激后，CUL4B缺失引起p53半衰期的延长而CUL4B过表达则引起p53半衰期的缩短，并且我们在NHF细胞中检测到CUL4B蛋白与p53蛋白的直接结合，进一步的泛素化水平检测也验证了压力刺激后CUL4B促进p53的泛素化。这些结果表明CUL4B通过直接促进p53泛素化而抑制p53-ROS正反馈环并最终减缓细胞早衰。
细胞衰老;CUL4B蛋白;p53基因;活性氧;正反馈环;压力刺激
山东大学
博士
遗传学
邵常顺
2015
中文
R329.25
176
2015-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）