基于四氧化三铁纳米磁转化系统的花粉介导棉花转基因技术
磁性纳米颗粒作为一种非病毒基因载体已经获得广泛的生物应用，纳米载体能够有效地结合核酸对成功地实现基因传输十分关键。然而，对于纳米载体和DNA的负载机制、及其对于转基因效率的影响的研究相对较少。本文通过生物物理学和生物化学等表征手段，结合原子力显微镜、透射电子显微镜及扫描电子显微镜等，系统地研究了聚乙烯亚胺(PEI)修饰的磁性纳米载体(MNPs)的形貌特征、与DNA分子的结合形态以及对DNA的运载性能。通过将MNPs连接DNA形成MNP/DNA复合物，构建纳米基因载体系统。MNPs表面修饰大量氨基基团携带高密度的正电荷，将DNA分子吸附、压缩、聚集和缠绕在载体表面。这种紧密高效的连接不仅能够携带大量的DNA分子，同时对外源基因也起到有效地保护作用。PK15细胞的磁转染实验证实，MNPs具有较低的细胞毒性，并且能实现外源基因稳定和长效的表达。此外，剂量．效应分析表明，MNPs与DNA的结合比例形成了不同的MNP/DNA复合物形态，进而影响基因的表达效率。细胞内的荧光示踪证实，MNPs被细胞摄入穿过细胞膜，运输DNA至细胞核并释放，外源基因实现表达。本研究发展了一种稳定、便捷、高效的动物细胞双基因转化体系，在PK15细胞中成功实现了红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的协同表达。 转基因技术在植物的优良新品种培育上也发挥着重要作用。目前主要的植物转基因方法均需要通过繁琐、长周期的组织培养过程，尤其是一些作物品种，如棉花和大豆，组织再生困难，严重影响了遗传转化的进程。本研究利用磁性纳米载体转化棉花花粉，发展了一种植物转基因新方法，花粉磁转染。该方法以MNPs作为基因载体，负载外源DNA，在外界磁场下，MNPs将DNA导入棉花花粉，直接获得了转基因的种子，最终筛选得到转融合抗虫基因的棉花。经过分子检测和蛋白表达分析，外源基因成功地整合进入棉花基因组中，实现了抗虫蛋白的高效表达，并且在后代植株中稳定遗传。花粉磁转染法不需要组织培养过程，缩短了从转基因到获得种质材料的周期，受体材料不受基因型限制、来源广泛，操作便捷，便于大规模田间操作，有望成为一种平台技术在其他开花植物的转基因培育上获得广泛应用。本文的研究成果对发展动植物转基因新方法、加速转基因种质材料的大规模制备和优良新品种的培育进程具有重要意义。
棉花;花粉磁转染;转基因技术;四氧化三铁磁性纳米磁转化系统
中国农业科学院
博士
生物物理学
崔海信
2015
中文
S562.01
96
2015-09-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）