烟草脉带花叶病毒非翻译区顺式作用元件的解析及马铃薯X病毒超表达及沉默载体的构建
复制在病毒的整个生命循环中非常关键。病毒的复制受基因组中顺式作用元件的调控，而这些元件多数位于基因组末端的5'-和3'-非翻译区(untranslated region，UTR)内，因此研究病毒的UTR与侵染的关系对解析其中顺式作用元件、理解病毒复制过程十分重要。本研究以烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）侵染性克隆为研究材料，通过缺失基因组5'-UTR和3'-UTR的不同序列，明确影响病毒侵染的顺式作用元件。 植物病毒侵染性克隆不单是研究病毒侵染的有力工具，它也可以改造为超表达载体，用来生产具有商业价值的功能蛋白;以及病毒介导的基因沉默载体(virus inducedgene silencing，VIGS)，用来研究植物内源基因的功能。本研究以PVX1985分离物构建了能通过农杆菌浸润的侵染性克隆pCaPVX100，并改造为超表达载体pCaPVX440及pCaPVX760，VIGS载体pCaPVX440-LIC。主要研究结果如下: (1)从TVBMV5'-UTR(171 nt)的5'-端依次缺失7、25、64、150和171 nt，获得缺失突变体5'-Δ1-7、5'-Δ1-25、5'-Δ1-64、5'-Δ1-150和5'-Δ1-171。通过农杆菌浸润将上述突变体分别接种本氏烟，以接种野生型pCaTVBMV-GFP(wt)的植株为对照。结果发现突变体5'-Δ1-7、5'-Δ1-25、5'-Δ1-64、5'-Δ1-150能够系统侵染本氏烟，但随着缺失区域的扩大，系统侵染所需要的时间越长，病毒RNA的积累量越低，而突变体5'-Δ1-171不能系统侵染本氏烟。 除突变体5'-Δ1-7的部分子代RNA回复为wt外，5'-Δ1-25、5'-Δ1-64、5'-Δ1-150的子代RNA没有回复为wt序列，但在其基因组的5'-端都添加了富含AU的序列。即使是同一突变体的子代RNA，5'-端所加AU的数量及顺序都不相同，然而所有突变体的子代RNA在5'-末端都具有类似wt的A4-6U序列。 为了明确各子代病毒基因组5'-端富含AU的序列是否还会继续变化，我们将5'-Δ1-64、5'-Δ1-150系统侵染的叶片分别通过摩擦接种本氏烟进行传代，发现第5代病毒RNA的序列与第1代的序列不同，并出现了主导序列。将这两种主导序列分别添加到5'-Δ1-64、5'-Δ1-150基因组的5'-末端获得衍生物5'-Δ1-64-5、5'-Δ1-150-5，发现其比原始突变体发病所需时间缩短，说明主导序列的插入有利于病毒的侵染。 带有5'-Δ1-25、5'-Δ1-64、5'-Δ1-150的农杆菌混合后浸润本氏烟，子代RNA的序列全是5'-Δ1-25的子代RNA序列，说明缺失碱基数少的突变体子代RNA在侵染的过程中具有优势。 将TVBMV5'-UTR的26-171 nt进行分段缺失，获得缺失突变体5'-Δ26-64、5'-Δ65-100、5'-Δ101-125、5'-Δ126-150、5'-Δ151-160及5'-Δ161-171。接种结果表明，突变体5'-Δ65-100、5'-Δ101-125、5'-Δ126-150的系统发病时间及病毒RNA的积累和野生型病毒一致。5'-Δ26-64侵染的植株荧光亮度低，RNA积累少而5'-Δ151-160侵染的植株荧光亮度及病毒的RNA积累量比wt的高。测序发现上述各突变体的子代RNA与父代的基因组完全一致。将带有5'-Δ161-171的农杆菌接种本氏烟，发现植株的系统发病时间比wt的要长，其子代RNA在父代缺失位点的序列相当多样。32个克隆中有3个在父代缺失位点处没有变化，其余29个克隆在该位点都添加了11nt的序列，与基因组172-182 nt类似，说明TVBMV5'-UTR中161-171 nt的缺失不是致命的，但降低了病毒的侵染速度。 将突变体5'-Δ1-25编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)活性中心的序列进行突变，使GDD突变为GAA，获得Δ1-25-GAA。以Δ1-25-GAA浸润的叶片中的转录产物进行5'-RACE。结果显示Δ1-25-GAA5'-端的序列没有增加，说明有活性的RdRp是病毒基因组修复所必需的。突变体5'-Δ1-150能够系统侵染本氏烟，但不能系统侵染普通烟，说明病毒的修复还与寄主因子有关。 (2)从TVBMV3'-UTR(184 nt)的5'-端依次缺失，获得缺失突变体3'-Δ1-20和3'-Δ1-60，通过农杆菌浸润接种本氏烟，发现接种3'-Δ1-20的植株能系统发病。测序发现3'-Δ1-20的子代RNA在缺失位点都插入了14nt的序列。Mfold分析表明，在TVBMV基因组中3'-UTR8-42 nt折叠成一个不完全配对的茎环结构，新插入的14 nt可以使TVBMV基因组在该区域形成完全配对的茎环结构。为了进一步明确3'-UTR中的8-60 nt序列在病毒侵染过程中的重要性，获得突变体3'-Δ8-42、3'-Δ8-14、3'-Δ15-35及3'-Δ36-42，通过农杆菌浸润接种本氏烟，发现接种3'-Δ8-14、3'-Δ15-35及3'-Δ36-42的本氏烟能够发病，而接种3'-Δ8-42的本氏烟没有发病。结合测序结果显示该茎环结构在病毒侵染过程中起着非常重要的作用。Mfold预测该茎环结构在烟草脉斑驳病毒、小西葫芦黄花叶病毒等马铃薯Y病毒属成员中是保守的。 从TVBMV3'-UTR的内部进行缺失，获得缺失突变体3'-Δ43-60、3'-Δ61-100、3'-Δ101-141、3'-Δ142-162及3'-Δ163-174，接种本氏烟发现仅缺失3'-UTR中142-162 nt后能够致病，说明TVBMV3'-UTR142-162 nt的缺失不影响病毒的侵染，但病毒RNA的相对积累量低于wt。 从TVBMV基因组3'-端缺失10nt的突变体能侵染本氏烟，但系统症状明显延迟。缺失更多碱基的突变体则丧失生命力。缺失2-10 nt突变体的子代RNA3'-末端发生了修复，仅部分回复为wt的序列。 (3)成功构建了PVX的侵染性克隆，并将其改造为超表达载体和VIGS载体。将35S启动子克隆到PVX1985全基因组序列上游，一起连接到pCambia0390，获得了侵染性克隆pCaPVX100。该克隆可以通过农杆菌浸润接种，在本氏烟、普通烟NC89、番茄及马铃薯上引起的症状和野生型病毒一致。在pCaPVXI00的TGB及CP之间插入PVX CP启动子及TMV CP启动子及相应克隆位点，构建成能够同时表达两种外源基因的超表达载体pCaPVX440。将pCaPVX440中部分CP序列替换为一个多克隆位点，获得pCaPVX760。利用该载体可以高水平表达外源蛋白。将LIC(Ligation independent cloning，LIC)序列引入pCaPVX440载体，获得不依赖于连接的PVX沉默载体pCaPVX440-LIC。将本氏烟pds的部分基因分别以正向和反向的方式连入该载体获得pCaPVX440-LIC-PDS和pCaPVX440-LIC-PDSas，接种植株都出现光漂白症状。通过半定量RT-PCR检测到具有光漂白症状的植株内源pds的积累量明显降低，说明该载体可用于沉默外源基因。
烟草脉带花叶病毒;马铃薯X病毒;非翻译区;顺式作用元件;超表达载体;沉默载体
山东农业大学
博士
微生物学
杨正友
2014
中文
S432.41
96
2015-09-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）