HCV core蛋白诱导巨噬细胞负调控分子A20高表达及机制研究
目的:主要研究HCV core蛋白作用的巨噬细胞细胞因子的分泌及负调控分子A20的表达情况，并揭示相关机制，旨在探讨HCV core蛋白作用下巨噬细胞的功能变化，这将有助于了解巨噬细胞在HCV慢性感染中的功能角色，为揭示HCV的致病机理及研究治疗方案提供新的视角。 方法:1.通过原核表达蛋白系统，表达并纯化HCV core蛋白，行SDS-PAGE和Western blot鉴定。HCV core蛋白经内毒素去除试剂盒处理后，用显色基质鲎试剂盒检测内毒素的含量，并用Bradford法定量HCV core蛋白。 2.人单核细胞THP-1经PMA诱导48 h即分化为巨噬细胞状态MΦ-THP-1。不同浓度HCV core蛋白（1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）作用巨噬细胞（MΦ-THP-1）3h和6h，Western blot检测负调控分子A20的表达变化，确定HCV core蛋白的使用浓度。用特定浓度HCV core蛋白作用巨噬细胞MΦ-THP-1及小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM，不同时间段检测A20表达变化情况。 3.构建针对A20的shRNA干扰质粒，经慢病毒包装，感染THP-1单核细胞，建立干扰A20的稳定细胞系THP-1-sh-A20，同时建立干扰luciferase的对照细胞系THP-1-sh-luciferase。两细胞经PMA诱导分化为巨噬细胞状态(MΦ-THP-1-sh-A20和MΦ-THP-1-sh-luciferase)。HCV core蛋白分别作用两个巨噬细胞，3h、6h取样，Western blot检测A20的表达变化，验证A20的干扰效果。 4.HCV core蛋白作用巨噬细胞（MΦ-THP-1），于4h、8h、12h、24hCBA检测细胞培养上清中细胞因子TNF、IL-6、IL-1β和TGF-β1的表达情况，同时亦将core蛋白分别作用的干扰了A20的细胞及对照细胞，检测培养上清中与上相同细胞因子的表达，以确定细胞因子的分泌与负调控分子A20表达的关系。 5.Pull-down实验:将结合在Ni Agarose上的HCV core蛋白与MΦ-THP-1细胞裂解液作用，体外进行Pull-down实验，应用gC1qR、TLR2及TLR4抗体研究HCV core蛋白与巨噬细胞膜受体gC1qR、TLR2及TLR4的结合情况。 6.以gC1qR的配体C1q纯品（终浓度70μg/ml）作用巨噬细胞（MΦ-THP-1）6h，Western blot检测并证明巨噬细胞负调控分子A20的表达。 7.构建针对gC1qR的shRNA干扰质粒，经慢病毒包装，感染THP-1单核细胞，建立干扰gC1qR的稳定细胞系THP-1-sh-gC1qR，经PMA诱导分化为巨噬细胞状态(MΦ-THP-1-sh-gC1qR)。Western blot验证gC1qR的干扰效果，同时以MΦ-THP-1-sh-luciferase、MΦ-THP-1为对照。 8.HCV core蛋白分别作用干扰gC1qR的细胞及对照细胞，不同时间取样，Western blot检测A20的表达变化情况，明确负调控分子A20产生与受体gC1qR的关系。 9.HCV core蛋白作用巨噬细胞（MΦ-THP-1）及小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，不同时间取样，Western blot检测信号分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT的表达变化。 10.HCV core蛋白分别作用干扰gC1qR的细胞（MΦ-THP-1-sh-gC1qR）和对照细胞（MΦ-THP-1-sh-luciferase）不同时间，Western blot检测p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT蛋白的表达变化，明确与gC1qR活化有关的信号通路。 11.gC1qR的配体C1q作用巨噬细胞MΦ-THP-130 min，Western blot检测信号分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κBp105、p-AKT的表达变化，验证gC1 qR活化相关的信号通路。 12.不同浓度的化学抑制剂SB203580（p38抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）、PD98059（ERK抑制剂）、IMD0354（IKKβ抑制剂）、Wortmannin（PI3K抑制剂）、MK22062HCl（AKT抑制剂）分别预处理巨噬细胞(MΦ-THP-1)30 min，再用HCV core蛋白继续作用30 min，Western blot分别检测p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-AKT蛋白的表达变化。以最佳作用浓度的抑制剂分别预处理巨噬细胞30 min，再用HCV core蛋白继续作用3h、6h，Western blot检测负调控分子A20的表达变化，明确信号通路与诱导A20高表达的关系。 结果:1.成功表达、纯化了HCV core蛋白，SDS-PAGE和Western blot证实为单一目的条带。 2.HCV core蛋白可诱导巨噬细胞负调控分子A20高表达 3.成功建立干扰A20的稳定细胞系THP-1-sh-A20 将A20的shRNA干扰质粒感染THP-1单核细胞，建立干扰A20的稳定细胞系THP-1-sh-A20，同时建立干扰luciferase的稳定细胞系THP-1-sh-luciferase为对照。继而以HCV core蛋白作用两种细胞，分别于3h和6h检测，干扰组A20表达明显低于对照组（P＜0.05），干扰效果明显。 4.HCV core蛋白可诱导巨噬细胞分泌细胞因子，其中IL-6、IL-1β和TGF-β1表达受A20负向调节 5.HCV core蛋白与gC1qR结合诱导A20表达 6.HCV core蛋白与gC1qR结合可活化巨噬细胞MAPK、NF-κB及PI3K/AKT信号通路 HCV core蛋白作用巨噬细胞(MΦ-THP-1)及小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)15 min、30 min、1h，Western blot检测，信号分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κBp105、p-AKT的表达均明显升高(P＜0.05)。 将HCV core蛋白作用干扰 gC1qR的巨噬细胞（MΦ-THP-1-sh-gC1qR），不同时间段，与三条通路相关的信号分子p-p38、p-JNK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT的表达均明显低于对照细胞（MΦ-THP-1-sh-luciferase）(P＜0.05)。 而以C1q作用巨噬细胞(MΦ-THP-1)30 min，显示p-p38、p-JNK、p-ERK、p-AKT蛋白表达明显升高(P＜0.05)，而p-NF-κB p65、p-NF-κBp105蛋白表达无变化。 以上结果提示:虽然C1q、HCV core蛋白都是受体gC1qR的配体，但结合方式、涉及的信号通路依然存在差异。 7.p38、JNK和NF-κB信号通路的活化在HCV core蛋白诱导巨噬细胞A20高表达中起主要作用 首先，经过系列相关实验，确定了以下各抑制剂的使用浓度: p38抑制剂SB203580的应用浓度为30μM; JNK抑制剂SP600125的应用浓度为20μM;ERK抑制剂PD98059为50μM; IKKβ抑制剂IMD0354为3μM;PI3K抑制剂Wortmannin为200 nM; AKT抑制剂MK22062HCl为5μM。 结果显示:化学抑制剂SB203580、SP600125、IMD0354可以抑制HCV core蛋白诱导的巨噬细胞A20高表达(P＜0.05)，而PD98059、Wortmannin、MK22062HCl对HCV core蛋白诱导的A20高表达无抑制作用。提示p38、JNK和NF-κB信号通路的活化对诱导A20高表达起主要作用。 结论:1.HCV core蛋白可诱导巨噬细胞负调控分子A20高表达，A20的表达可负向调节HCV core蛋白诱导的IL-6、IL-1β和TGF-β1的分泌。 2.HCV core蛋白通过与gC1qR结合诱导巨噬细胞A20高表达。 3.HCV core蛋白与gC1qR结合可活化巨噬细胞MAPK信号通路中的p38和JNK通路、NF-κB信号通路和PI3K/AKT信号通路，其中p38、JNK和NF-κB信号通路的活化在HCV core蛋白诱导巨噬细胞A20高表达中发挥主要作用。
丙型肝炎病毒感染;致病机制;结构蛋白;巨噬细胞;负调控分子;高表达现象
河北医科大学
博士
免疫学
魏林
2015
中文
R512.630.2
121
2015-09-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）