棉花秸秆木质纤维素降解及其青贮复合菌系的筛选和协同机理研究
为推进我国新疆棉秆作为粗饲料利用的进程，缓解新疆饲草资源短缺，针对棉花秸秆降解方面的研究，首先对棉花秸秆的预处理进行优化，确定其最适预处理方法;其次筛选适宜棉花秸秆青贮的乳酸菌复合菌系和木质纤维素降解复合菌系。从青贮样品中、禾本科牧草中分离乳酸菌，利用16SrDNA和生理生化指标测定对乳酸菌株进行鉴定。采用PCR-DGGE技术对青贮复合系的稳定性和多样性进行分析;筛选降解棉花秸秆纤维素复合系，利用微生物分泌的纤维素复合酶加快木质纤维素分解，测定纤维素复合系的降解能力和酶活性，采用PCR-DGGE技术对木质纤维素降解复合菌系的稳定性和多样性进行分析。 棉秆预处理和酶解，在碱与微波同时处理基础上添加绿色木霉处理失重率最高(18.90％)，碱与微波同时处理后添加绿色木霉处理酶解率最好(31.84％);硫酸处理糖化率最高(18.30％);碱与微波同时处理后的棉杆经绿色木霉处理后葡萄糖得率最高(1.01％)，预处理和酶解都能提高纤维素的降解率。 青贮乳酸菌的鉴定结果，鉴定出了8种分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenniformis）、面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属(Staphylococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。筛选出了适合棉花青贮的青贮复合菌系，青贮复合菌系连续培养到第20代后趋于稳定，通过PCR-DGGE分析和测序结果，青贮复合菌系主要由B.lichenniformis，L.crustorum，L.rhamnosus和L.casei组成。 分离出了降解木质纤维素的菌株5株，在连续培养20d，对纤维素和木质素的降解率分别为XT4:20.91％、13.71％; XT3:21.43％、9.46％; XT2:22.19％、11.76％; XM4:16.74％、11.45％; XM3:19.74％、11.16％。把5株纤维素降解菌与木质素降解菌黄孢原毛平革菌进行混合发酵，通过固体发酵20d，混合发酵能够提高棉花秸秆中木质纤维素降解率，结果分别为XT2+PC:34.26％、25.44％; XT3+PC:29.29％、28.69％、XT4+PC:35.09％、27.61％、XM4+PC:27.67％、32.4％; XM3+PC:44.11％、19.5％。棉秆木质纤维素降解菌株初步鉴定结果T2、M3和T4为Claodosporium、Aspergillus、Penicillium; T3为Bacillus subtilis，M4为Bacillus megaterium。 采用PCS培养基对牛粪、土壤、瘤胃和发酵粪中筛选纤维素分解复合菌系，进行连续继代培养，获得稳定的复合菌系，在连续继代20代后，仍保持稳定的降解效果。对棉秆木质纤维素降解复合菌系进行了发酵优化;对木质纤维素降解复合菌系进行了优化，氮源种类、发酵起始pH和接种量对CMC、FPA、β-G酶活和糖化率和失重率的影响达到极显著水平(p＜0.01)，温度对FPA酶和失重率的影响达到显著水平(p＜0.05)，对糖化率的影响达到显著水平(p＜0.05)，对CMC、β-G酶的影响未达到显著水平。得出最优的发酵工艺为:温度42℃，氮源(NH4)2SO4，接种量1.0％，发酵起始pH值7.0。 添加PEG6000的内切酶、β-G和FPA酶活性增加幅度最高，分别达到93.33％，136.93％和73.15％，PEG4000对外切酶活性增幅最大;PEG6000能提高MnP和LiP酶的活性，分别为110.89％和62.29％。PEG2000、4000、6000和8000，纤维素降解率由没有添加表面活性剂的19.48％分别提高到24.5％，26.71％，33.1％和30.01％;木质素纤维素降解率对照的9.91％分别提高到19.21％，22.51％，30.45％和27.76％，其中PEG6000效果最好。添加3.0g/L PEG6000纤维素的转化率最高，达到58.12％(p＜0.05);添加3.0g/L PEG6000能保持上清液中较高的蛋白浓度，水解3h后，没有PEG6000,FPA从0.1245 FPU/mL下降到0.012FPU/mL，下降了90.37％，添加PEG6000，FPA酶的活性恢复到0.041FPU/mL;水解48h，添加PEG6000和不添加PEG6000纤维素的转化率分别达到65.71％和54.68％，添加PEG6000提高纤维素转化率20.18％。PEG6000可以提高木质纤维素的转化率。 青贮复合菌系、木质纤维素降解复合菌系与白腐菌协同作用测定结果，白腐菌与木质纤维素降解复合菌系发酵，β-G葡萄糖苷酶(β-G)、锰酶(MnP)和漆酶(Lac)分别提高了23.34％、85.85％和150.00％;青贮复合菌系与木质纤维素降解复合菌系发酵， CMC和β-G酶分别被提高了41.98％和48.22％。青贮复合菌系、木质纤维素降解复合菌系与白腐菌协同发酵，Lac、木质素过氧化物酶(LiP)、CMC和β-G分别被提高了50.00％、41.18％、29.75％和84.85％。木质纤维素降解复合菌系发酵，葡萄糖转化系数最高达26.86％。棉秆失重率为24.27％～52.87％。青贮复合菌系、木质纤维素降解复合菌系与白腐菌协同发酵，半纤维素被降解42.69％，纤维素被降解44.30％，木质素被降解30.45％。CP含量被提高5.06％～9.37％。白腐菌与木质纤维素降解复合菌系发酵，DM降解率达到最高。棉秆纤维素降解菌系、白腐菌和青贮乳酸菌在木质纤维素生物降解过程中的协同作用可以大大提高棉秆在体外和尼龙袋中的降解效率。
青贮饲料;棉花秸秆;木质纤维素;降解能力;乳酸菌复合菌系;菌种筛选;协同机理
东北农业大学
博士
草业科学
马春晖
2014
中文
S816.533
121
2015-09-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）