α-甘露糖苷酶活性在沙眼衣原体侵染细胞中的作用及其诊断价值的研究
α-甘露糖苷酶(α-mannosidase)是一种糖苷水解酶，在N-连接糖蛋白的合成和加工中具有重要作用。有关α-甘露糖苷酶的研究虽然较多，但研究对象主要集中在真核生物，对原核生物特别是病原原核生物的α-甘露糖苷酶研究相对较少。随着特异性酶显色技术逐步发展，酶显色技术用于α-甘露糖苷酶活性测定成为可能。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）临床检测虽然有多种方法，如细胞培养法、免疫学方法、生化方法以及分子生物学方法，但这些方法均存在一些问题，如细胞培养法和胶体金免疫法的敏感性较低，而且细胞培养法不易用于临床，生化方法的特异性不强，分子生物学方法的操作复杂及费时较长等，这些问题已严重影响沙眼衣原体感染的临床检测。随着显色培养基技术和酶显色技术的发展，酶法快速检测微生物已成为目前临床微生物检测的一个方向。泌尿生殖道常见病原微生物以及沙眼衣原体多数流行株是否有僻甘露糖苷酶以及酶活性如何，将决定静甘露糖苷酶活性对沙眼衣原体临床检测是否有潜在的诊断价值。如果α-甘露糖苷酶活性可以作为诊断标志物，那么沙眼衣原体α-甘露糖苷酶的分离提纯、α-甘露糖苷酶活性对沙眼衣原体侵染细胞是否有影响、这种影响是否有特异性以及以此建立弘甘露糖苷酶活性诊断沙眼衣原体感染方法的性能和能否产品化等问题都值得深入研究。为了详细研究这些问题，本论文共分为以下三个部分来阐明洳甘露糖苷酶活性在沙眼衣原体侵染细胞中的作用及其诊断价值。 第一部分泌尿生殖道常见微生物α-甘露糖苷酶活性研究 目的: 研究泌尿生殖道常见微生物在α-甘露糖苷酶活性快速检测中所表现活力，以期确定α-甘露糖苷酶活性对临床沙眼衣原体感染是否有快速诊断价值。 方法: 1.以泌尿生殖道常见的微生物包括18种细菌、7种念珠菌、2种支原体和1种原虫共计28株标准菌株和40株临床分离菌株以及2株沙眼衣原体不同血清型标准株进行培养。 2.把培养所得的各种微生物分别以离心洗涤和不洗涤的方式收集培养物。 3.沙眼衣原体和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)分别以超声波细胞破碎和不破碎的方式收集培养物，白色念珠菌(Candida albicans)分别以冷冻研磨破碎和不破碎的方式收集培养物。 4.分别以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作为α-甘露糖苷酶显色底物，测定各种培养物在37℃不同反应时间(10、30和60min)的570 nm和512nm吸光度。 结果: 1.沙眼衣原体血清型D株对HeLa229细胞侵染率（被侵染的细胞占视野内所有细胞的比率）(18.75％、24.06％和17.65％)低于沙眼衣原体血清型E株对HeLa229细胞侵染率(59.69％、62.96％和53.85％)。经卡方检验，两者侵染率概率分布差异具有统计学意义（x2=16.273，P＜0.05）。 2.以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作为α-甘露糖苷酶显色底物，沙眼衣原体血清型D株和E株所呈现的α-甘露糖苷酶活性均明显高于其他微生物的，差异具有统计学意义(P＜0.05)，α-甘露糖苷酶活性对临床沙眼衣原体感染有快速诊断价值。阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和部分念珠菌也表现微弱的α-甘露糖苷酶活性，吸光度达到0.150～0.250。 3.对各种微生物培养收集物在不同条件下分别得到的OD570和OD512应用重复测量资料的方差分析方法，发现不同的显色底物(F=103.251，P＜0.05)、洗涤与否(F=88.253，P＜0.05)及显色时间(F=213.235，P＜0.05)均对检测结果有统计学意义。 4.以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作为酶底物显色慢而且浅（未破碎的沙眼衣原体血清型D株10、30和60 min OD570分别为0.159、0.221和389，未破碎的沙眼衣原体血清型E株10、30和60 min OD570分别为0.147、0.198和0.358），两株血清型OD570的差异无统计学意义(F=2.605，P＞0.05)。而以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作为酶底物显色相对快而且深（未破碎的沙眼衣原体血清型D株10、30和60 min OD512分别为0.519、0.607和1.826，未破碎的沙眼衣原体血清型E株10、30和60 min OD512分别为0.588、0.957和2.025），两株血清型OD512的差异也无统计学意义(F=1.845，P＞0.05)。 第二部分沙眼衣原体α-甘露糖苷酶分离纯化及酶活性对沙眼衣原体侵染细胞的影响 目的: 研究沙眼衣原体α-甘露糖苷酶分离纯化方法和α-甘露糖苷酶活性对沙眼农原体侵染细胞的影响及这种影响的特异性。 方法: 1.破碎的沙眼衣原体血清型D株细胞培养物经过离心、超声波破碎、硫酸铵分级沉淀及SephadexG-100柱层析纯化分离纯化α-甘露糖苷酶，纯化后的α-甘露糖苷酶采用SDS-PAGE鉴定酶纯度并测定酶的分子量。 2.纯化的α-甘露糖苷酶免疫兔子制备抗α-甘露糖苷酶血清，抗血清经硫酸铵沉淀及Sepharose CL-4B亲和层析纯化后，采用免疫双扩散测定纯化抗α-甘露糖苷酶多抗效价。 3.纯化的α-甘露糖苷酶、抗α-甘露糖苷酶多抗及刀豆源的α-甘露糖苷酶分别以三种浓度（0.02、0.1和0.5 mg蛋白/ml培养基）加入DEAE-葡聚糖溶液处理过的HeLa229单层细胞，然后接种沙眼衣原体血清型D株，培养后直接免疫荧光染色镜检观察沙眼衣原体侵染率的差异，不加α-甘露糖苷酶和抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原体血清型D株侵染培养物作为对照。 结果: 1.SDS-PAGE分析发现纯化的沙眼衣原体血清型D株α-甘露糖苷酶电泳只有一条蛋白条带，分子量约为50kDa。 2.抗α-甘露糖苷酶血清抗体滴度为1/64，纯化后，抗α-甘露糖苷酶多抗滴度也为1/64。 3.加入纯化抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原体血清型D株的侵染率与对照的侵染率总体概率分布差异具有统计学意义(x2=137.062，P＜0.05)，而且具有随添加浓度升高而降低的趋势(x2=65.328，P＜0.05)。加入纯化α-甘露糖苷酶的沙眼衣原体血清型D株侵染率与对照的侵染率总体概率分布差异也具有统计学意义(x2=117.539，P＜0.05)，而且具有随添加浓度升高而升高的趋势(x2=98.227，P＜0.05)。而加入刀豆源的α-甘露糖苷酶的沙眼衣原体血清型D株的侵染率与对照的侵染率总体概率分布差异不具有统计学意义(x2=0.096，P＞0.05)。 第三部沙眼衣原体α-甘露糖苷酶活性检测方法的建立及临床评价 目的: 以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作为酶显色底物，建立适合临床需要且能够产品化的酶法沙眼衣原体检测方法，评价其各项性能，为沙眼衣原体临床诊疗服务。 方法: 1.以基本检测体系为基础，对影响配方的各因素先进行单因素多水平试验及分析，再据此进行四因素三水平正交设计与直观分析，经正交验证并结合反应时间的调整等筛选出最佳配方，判断的出发点是下面公式中的“M”值越大越好。M=(AD+AE-B-C)/2 其中M为阳性结果OD512与干扰结果OD512的差值，AD为沙眼衣原体血清型D株培养物酶法检测OD512的值，AE为沙眼衣原体血清型E株培养物酶法检测OD512的值，B为两株白色念珠菌培养物酶法检测OD512的均值，C为两株化脓性链球菌培养物酶法检测OD512的均值。 2.确定所建立的酶法沙眼衣原体检测限(LOD)和酶检测限，并用尿道分泌物、宫颈分泌物、阴道分泌物、前列腺按摩液及精液标本等多种共计665例临床标本初步评估阳性率，以确定进行临床性能评估的标本类型。 3.用尿道分泌物、宫颈分泌物、阴道分泌物及前列腺按摩液等多种共计553例临床标本评估所建立的酶法临床性能，与细胞培养法及连接酶链反应法(LCR)对比，参比方法采用“扩大的金标准”即细胞培养和LCR两种方法检测结果中有一个阳性即为真阳性，而不论酶法结果如何。 4.确定所建立的酶法及质控参考品有效期。 结果: 1.正交分析固紫B盐浓度影响最大，而0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH则影响最小。但正交验证发现正交表中的实验6所采用的配方优于直观分析的最佳水平组合，考虑检测时间的临床价值以及在此基础上TritonⅩ-100浓度的影响，在37℃孵育15 min的反应条件下，筛选最佳配方为:显色剂为2 mg/ml6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷溶液，溶剂为含0.75％(v/v) TritonⅩ-100的0.1 mol/L、pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;固紫B盐溶液浓度为1.5 mg/ml，溶剂为生理盐水;样品稀释液为不含底物的显色剂。 2.酶法沙眼衣原体检测限和酶检测限分别是617 IFU/ml和10-3 u/ml，尿道分泌物、宫颈分泌物、阴道分泌物、前列腺按摩液和精液标本的阳性率分别是11.11％、12.74％、9.91％、27.27％和93.33％，说明精液对酶法有干扰，前列腺按摩液也可能有干扰。 3.前列腺按摩液有干扰，但排除前列腺按摩液标本后，酶法检测沙眼衣原体灵敏度和特异性分别是91.8％(95％CI，86.0％～97.6％)和98.3％(95％CI，97.1％～99.5％)，与扩大的金标准之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。 4.α-甘露糖苷酶法检测体系产品2℃～8℃贮存有效期为23个月，质控参考品-20℃贮存有效期为5.5个月。 结论: 1.α-甘露糖苷酶活性对沙眼衣原体感染是有潜在价值的诊断标志物。 2.纯化后的沙眼衣原体血清型D株α-甘露糖苷酶分子量约为50kDa。 3.α-甘露糖苷酶活性的高低可明显特异性地影响沙眼衣原体血清型D株侵染敏感细胞能力。 4.本文建立的快速检测α-甘露糖苷酶活性的方法，可用于诊断沙眼衣原体感染的临床诊断，具有较大的临床应用价值。
沙眼衣原体;α-甘露糖苷酶;酶活性;诊断标志物;有效期;泌尿生殖道
郑州大学
博士
基础医学
崔晶
2014
中文
R446.5
113
2015-06-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）