ATM/Nf-kappaB通路在促炎因子TNf-alpha、Il-6促肺癌细胞迁移中的作用研究
[背景和目的]免疫微环境在肺癌的侵袭转移过程中起着重要作用，TNF-α和IL-6作为两种重要的促炎因子，参与了免疫、炎症反应及肿瘤发生发展的全过程，为肿瘤相关炎症的关键调节分子且可通过上调p38、ERK、NF-κB通路诱导MMPs的表达最终促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，但这一机制在肺癌中尚不明确。ATM作为DNA损伤信号传导通路中最早的传感和中枢调控基因，可以多种途径激活NF-κB，从而调控下游靶基因的表达。此外，最近研究发现TGF-β1可激活ATM调控乳腺癌细胞的迁移。这些研究表明，ATM除参与DNA损伤修复外，还与肿瘤细胞的转移相关。因此，炎症因子TNF-α、IL-6对肺癌细胞迁移能力的影响及ATM是否参与其中则为本文研究的重点。 [方法]首先以Real-time PCR、ELISA技术和Transwell细胞迁移实验检测肺癌细胞系NCI-H446、A549在TNF-α、IL-6表达及细胞迁移能力上的差异;其次以MMPs抑制剂、siRNA基因沉默技术抑制/沉默相应MMPs表达，Transwell细胞迁移实验筛选影响肺癌细胞系NCI-H446、A549迁移能力的关键MMPs，并以Western blot、RT-PCR、Real-time PCR验证TNF-α、IL-6所增强的细胞迁移能力之关键MMPs;再以Western blot、激光共聚焦显微镜观察TNF-α、IL-6致ATM、MAPK、NF-κB通路激活的基础上，以相关激酶抑制剂或siRNA阻遏或沉默相关激酶活性，以Real-time PCR研究相关激酶在TNF-α、IL-6上调介导肺癌转移关键MMPs表达中的作用及以Transwell细胞迁移实验探究上述激酶在TNF-α、IL-6促肺癌转移中的作用;最后对肺癌微环境各组分给予LPS或化疗药处理，以Real-time PCR、ELISA、流式细胞术分别探究促炎因子TNF-α、IL-6的来源及表达机制。 [结果](1)与高表达TNF-α、IL-6相一致，肺癌细胞A549相较于NCI-H446细胞具有较高的细胞迁移能力，面对低表达促炎因子TNF-α、IL-6的NCI-H446细胞补充相应促炎因子则显著提高其迁移能力，提示促炎因子TNF-α、IL-6与肺癌细胞的迁移能力直接相关;(2)促炎因子TNF-α、IL-6不仅时间依赖性地上调MMP-3、MMP-13的表达，而且也显著增强MMP-3、MMP-13的活性;MMPs广谱和窄谱抑制剂和MMP-3、MMP-13 siRNA基因沉默不仅抑制A549细胞的迁移能力，而且对促炎因子TNF-α、IL-6所增强的肺癌NCI-H446细胞迁移能力也有明显的逆转作用;(3) TNF-α、IL-6不仅显著激活ERK、p38激酶磷酸化，而且ATM和p65的磷酸化水平也因TNF-α、IL-6的作用而显著上调;(4)阻遏ATM活性可使TNF-α所上调的ERK、p38、p65磷酸化水平明显得到抑制，提示ATM是TNF-α激活ERK、p38和NF-κB通路的上游分子;(5)促炎因子TNF-α、IL-6通过激活ATM-ERK/p38-NF-κB通路促进肺癌细胞迁移;(6) TNF-α、IL-6通过激活ATM-ERK/p38-NF-κB通路上调MMP-3、MMP-13表达;(7) LPS及化疗药顺铂、喜树碱均可明显促进肺癌NCI-H446细胞、外周血淋巴细胞、成纤维细胞上调表达促炎因子TNF-α、IL-6;(8)顺铂、喜树碱通过激活ERK/p38-NF-κB通路促进IL-6分泌。 [结论]本课题以siRNA干扰或激酶抑制剂的使用研究ATM-ERK/p38-NF-κB通路在促炎因子TNF-α、IL-6促肺癌转移及化疗药顺铂、喜树碱上调IL-6的核心作用，明确了ATM-ERK/p38-NF-κB通路及MMP-3、MMP-13在TNF-α、IL-6促肺癌转移中的关键角色，进而阐明了ERK/p38-NF-κB通路在顺铂、喜树碱上调IL-6促进肺癌转移中的机制，为预防肺癌化疗后肿瘤转移提供潜在的治疗靶点。
免疫微环境;肺癌;侵袭转移过程;促炎因子
厦门大学
硕士
微生物学
高丰光
2014
中文
R734.2
78
2015-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）