NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证及初步应用研究
本研究分为三部分： 第一部分、NLS-RARα蛋白在电转质粒pCMV-HA-NE的NB4中定位的验证 目的:验证电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位。 方法:用质粒pCMV-HA-NE电转NB4细胞，分别用RT-PCR和Western blot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功;提取电转成功的NB4细胞的核蛋白，Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;用FITC-AnnexinⅤ/DAPI双染色免疫荧光法和FITC-AnnexinⅤ/PI双染色激光共聚焦法检测电转成功的NB4细胞中NLS-RARα的表达及定位。 结果:电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞成功表达NE基因和NE蛋白，且有NLS-RARα蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出电转NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达并推测其主要定位于胞核。 结论:成功用质粒pCMV-HA-NE电转NB4细胞，并用Western blot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。 第二部分、NLS-RARα蛋白在电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤中定位的研究 目的:研究电转质粒pCMV-HA-NE成功的NB4细胞裸鼠皮下移植瘤中NLS-RARα蛋白的存在及定位。 方法:将质粒pCMV-HA-NE电转进NB4细胞中，并用Western blot法验证其中NE蛋白的表达;建立电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤模型;提取成瘤细胞核蛋白，Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;FITC-AnnexinⅤ/DAPI双染色免疫荧光法、FITC-AnnexinⅤ/PI双染色激光共聚焦法、免疫组化法检测成瘤细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位。设立电转质粒pCMV-HA-KZ的NB4细胞、未电转NB4细胞两个对照组。 结果:电转成功，Western blot法检测到其中有NE蛋白表达。成功建立电转NB4细胞裸鼠皮下移植瘤模型;成瘤细胞中有NLS-RARα蛋白表达;FITC-AnnexinⅤ/DAPI双染色免疫荧光法、FITC-AnnexinⅤ/PI双染色激光共聚焦法、免疫组化法成功检测到其中NLS-RARα蛋白的表达，并推测其中NLS-RARα蛋白的表达主要位于胞核。 结论:成功用4种方法检测出成瘤细胞中的NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。 第三部分、NLS-RARα蛋白在APL病人血中性粒细胞中定位的验证 目的:验证急性早幼粒细胞白血病(APL)病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的存在并定位。 方法:用Western blot法验证病人血中性粒细胞的NE酶;提取病人血中性粒细胞核蛋白， Western blot法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;FITC-AnnexinⅤ/DAPI双染色免疫荧光法检测和FITC-AnnexinⅤ/PI双染色激光共聚焦法检测病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位。以电转质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位作阳性对照，以正常人血中性粒细胞中野生型RARα的表达和定位作阴性对照。 结果:阳性对照组设置成功。病人血中性粒细胞中存在NE酶且有NLS-RARα蛋白表达。根据细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测结果，推测病人血中性粒细胞中NLS-RARα蛋白的表达主要位于胞核。 结论:成功用3种方法检测出APL病人血中性粒细胞中的NLS-RARα蛋白的存在并推测其主要位于胞核。
中性粒细胞;电转质粒;急性早幼粒细胞白血病;动物模型;蛋白表达;免疫荧光法
重庆医科大学
硕士
临床检验诊断学
刘北忠
2014
中文
R733.71
54
2015-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）