人羊膜上皮细胞干预脂多糖诱导RAW264.7细胞向M1极化及其机制初步研究
目的：探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell，H-AEC)预防RAW264.7细胞在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导后向M1极化的作用和可能机制以及比较H-AEC、羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cell，HA-MSC)和脐带间充质细胞(Umbilical mesenchymal stem cells，UC-MSC)分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞系RAW264.7炎症状态的影响。为H-AEC在治疗炎症相关疾病的临床应用上提供理论基础。 方法： 细胞的分离和培养:通过胰酶（Trypsin/EDTA，T/E）消化法作用人胎盘羊膜，分离H-AEC;通过透明质酸酶(Hyaluronidase，H)，中性蛋白酶(Dispase，D)以及胶原蛋白酶(Collagenase，C)三酶联合消化法分别从人胎盘羊膜和脐带中分离HA-MSC和UC-MSC。 实验分组:(1) H-AEC干预LPS刺激RAW264.7极化实验分组:①空白对照组:RAW264.7正常培养48小时;②阳性对照组:RAW264.7正常培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时;③干预对照组:RAW264.7(2.5×105)和H-AEC(5×105) Transwell共培养48小时;④实验组:RAW264.7(2.5×105)和H-AEC(5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时。 (2)比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC干预LPS刺激RAW264.7极化实验分组:①阳性对照组:RAW264.7正常培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时;②H-AEC组:RAW264.7(2.5×105)和H-AEC(5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时;③HA-MSC组:RAW264.7(2.5×105)和HA-MSC(5×105)Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时;④UC-MSC组:RAW264.7(2.5×105)和UC-MSC(5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时。 检测方法:细胞划痕实验检测各组RAW264.7细胞的迁移能力;一氧化氮检测试剂盒检测各组RAW264.7细胞分泌NO的水平;用实时定量多聚酶链反应(real-time quantitative polymerase chainreaction，RT-PCR)检测各组细胞经典激活的巨噬细胞(classicallyactivated macrophage，M1 macrophage)相关的促炎基因以及旁路活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage，M2 macrophage)相关的抑炎基因表达情况;Western blotting检测(1)中各组RAW264.7胞质蛋白p-Iκ Ba以及胞核蛋白NFκB的表达;ELISA检测各组TGF-β1的分泌情况。 结果：(1)实验组RAW264.7细胞迁移率为14.7％±4.5％，与阳性对照组（31.1％±11.0％）相比，差异具有显著性(p＜0.05)。HA-MSC、UC-MSC组迁移率分别为14.7％±4.5％、9.6％±0.7％、13.0％±0.9％，与阳性对照组相比，差异具有显著性(p＜0.05)，但三组实验组无明显差异(p＞0.05)。(2)实验组共培养后RAW264.7细胞分泌NO的水平为24.26±0.72μM/L，与阳性对照组（45.65±1.78μM/L）差异具有显著性(p＜0.05)。HA-MSC、UC-MSC组NO浓度为44.52±2.51μM/L、42.25±0.76μM/L，与阳性对照组无显著性差异(p＞0.05)。(3)促炎基因与抑炎基因的表达改变:(A)实验组（H-AEC组）IL-1β、TNFa、NOS-2、INFβ等M1基因表达下调，CD206、CD36、Arg-1等M2基因表达上调，与阳性对照组相比有显著差别;(B) HA-MSC、UC-MSC组促炎基因INFβ表达下调显著，其余基因均上调表达;抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调;三组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、CD206、CD36表达均上调，与对照组有显著差异。(4)实验组降低了RAW264.7细胞中LPS激活的经典炎性通路NFκB上胞质蛋白p-IκBa以及胞核蛋白NFκB的表达量。(5)实验组下室TGF-β1分泌量大于上室，两者都大于H-AEC自身TGF-β1分泌量。 结论：人羊膜上皮细胞能有效抑制LPS刺激下的RAW264.7向M1极化且M2相关基因表达上调，其机制可能是通过抑制IκBa磷酸化阻止NFκB进入细胞核内启动M1型相关基因的表达。人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细胞向2型分化，但其效果和机制存在不同。
人羊膜上皮细胞;脂多糖;RAW264.7细胞;M1极化;炎症相关疾病;临床治疗
中南大学
硕士
基础医学
王建
2014
中文
R733.7;R730.21
52
2015-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）