hPROKR2受体C末端相互作用蛋白的筛选与功能研究
G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors， GPCRs)是迄今发现最大的受体超家族，其家族成员超过1000个。GPCRs一般包括7个跨膜区，3个细胞内环区(IL1-3)和位于胞浆的C末端。几乎所有细胞都表达种类多样的GPCRs，它们与配体结合后激活G蛋白，从而启动不同的信号通路并引起各种生物学效应。GPCRs不仅能与G蛋白相互作用，也与一些称做GPCRs互作蛋白(GPCRinteracting proteins， GIPs)的辅助蛋白相互作用。GIPs非常丰富，包括跨膜蛋白、离子通道、离子型受体、单次跨膜蛋白以及多种可溶性蛋白。这些蛋白质参与GPCRs的转运、靶向归巢、信号传导以及变构调节等。GIPs中较多的是与GPCRs的C末端相互作用。 PROKR2属于GPCR家族成员之一，与相应配体—PK1或PK2结合后，可参与平滑肌收缩、血管生成、近日节律调节、以及促进神经干细胞迁移。最近的遗传学研究表明PROKR2的突变与卡尔曼综合征(Kallmann Syndrome，KS)以及特发性促性腺激素型性腺功能减退(Isolated hypogonadotropic hypogonadism，IHH)发病有关。KS和IHH表现为青春发育延迟和不孕。因此，研究与PROKR2相互作用的蛋白，不仅可以增强对PROKR2功能调节的了解，而且可以促进一些KS/IHH相关基因的发现。 在本研究中，我们利用酵母双杂交技术，以人PROKR2的C末端(333-384aa)为饵，从人cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白。我们首先获得了8个有意义的cDNA克隆，从中我们选取SNAPIN进行进一步的研究。我们通过GST pulldown和免疫共沉淀实验不仅证实了PROKR2与SNAPIN的相互作用，而且发现SNAPIN也可以与PROKR2的同源蛋白PROKR1的C末端相互作用。进一步的研究表明SNAPIN中包含aa37-136的片段为相互作用所必须，该区域包含H1和H2两个α螺旋区。而PROKR2的C-末端的343YFK345和351HWR353是相互作用所必须。免疫共沉淀实验显示，将343YFK345和351HWR353突变成丙氨酸之后得到的突变受体6A-PROKR2不能与SNAPIN相互作用。 PROKR2与配体结合之后导致受体内吞，去掉配体之后，受体又可以迅速返回细胞膜。由于SNAPIN参与细胞内的囊泡运输，我们推测SNAPIN与PROKR2的相互作用可能参与了受体的内吞或者重新上膜。RNA干扰内源性SNAPIN之后，PROKR2的内吞不受影响，但是受体重新上膜受到抑制。相应地，受体降解速度增加。这些现象也在SNAPIN结合缺陷的6A-PROKR2得到验证。因此，我们的结果显示SNAPIN促进了PROKR2的重新回膜。 本研究得出以下结论: (1)通过酵母双杂交、GST pulldown以及免疫共沉淀，我们筛选到一个PROKR2相互作用蛋白—SNAPIN; (2)SNAPIN的相互作用区域位于aa37-136.其中包含H1和H2两个α螺旋区; (3)PROKR2的C-末端的343YFK345和351HWR353是其与SNAPIN相互作用所必需。YFK与HWR均为两个芳香族氨基酸，紧接一个碱性氨基酸。 (4)功能学研究表明SNAPIN有助于PROKR2内吞之后的重新上膜。
G蛋白偶联受体;酵母双杂交;hPROKR2受体;SNAPIN蛋白;C末端互作蛋白
中南大学
博士
基础医学
苏冰;李家大
2013
中文
Q516;Q786
172
2015-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）