IRS-1通过miR-143调节前脂肪细胞分化的作用与机制研究
目的： 了解间充质干细胞(MSC)向成脂细胞分化的机制，是多种代谢性疾病防治研究取得突破的关键之一。我们前期研究表明胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）能调节MSC向成骨细胞与脂肪细胞分化，建立了IRS-1基因剔除小鼠，找出了IRS-1基因剔除前后的骨髓基质细胞差异miRNA表达谱和基因表达谱。本研究将在此基础上进一步探讨IRS-1调节前脂肪细胞分化的具体机制及应用。 方法： 提取IRS-1纯合子、杂合子和野生型小鼠的脂肪、肝脏及骨骼肌组织，采用RT-qPCR检测miR-143在小鼠组织中的表达水平。克隆靶基因胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factors-1receptor，IGF1R)的3'-非编码区(3'-untranslated region，3'-UTR)的miR-143结合序列及其结合位点突变序列，并插入荧光素酶报告基因载体，合成miRNA mimics、miRNA抑制子，与报告基因载体共转染细胞，采用RT-qPCR法分析荧光素酶活性的变化。诱导3T3-L1细胞成脂分化，采用Western-blot技术检测靶基因IGF1R在诱导过程中的蛋白质水平，RT-qPCR技术检测IGF1RmRNA和miR-143的表达水平，分析miR-143和IGF1R在成脂细胞分化过程中的表达水平及两者之间的关系;然后将miR-143 mimics和miR-143 inhibitor转染至细胞中，观察前脂肪细胞脂滴分泌的变化。收集正常人群、代谢正常健康性者、代谢异常性肥胖者的血清，提取血清RNA，采用逆转录PCR技术和qRT-PCR技术检测miR-143的表达水平，比较3组之间的表达差异。 结果： 课题组通过分离IRS-1-/-小鼠骨髓间充质干细胞，抽提蛋白、RNA，结合分析miRNA芯片、PCR芯片和miRNA靶基因预测软件的结果，发现miR-143的靶分子包含IGF1R，我们利用RT-qPCR法检测miR-143在IRS-1纯合子、杂合子和野生型小鼠的脂肪、肝脏及骨骼肌组织中的表达水平，结果显示miR-143在IRS-1-/-小鼠组织中表达下调，与miRNA芯片结果一致。由此我们通过双荧光素酶报告基因分析以及突变后的荧光素酶报告基因分析，发现miR-143mimics能够显著抑制荧光素酶的活性，而miR-143抑制子能使荧光素酶活性增强，突变后miR-143抑制能力受到抑制，确认了IGF1R受miR-143的强效调控，为miR-143的靶基因，可能参与了IRS-1对脂代谢的复杂调控。为了对此进一步验证，我们采用Western-blot技术和RT-qPCR技术检测miR-143和IGF1R在诱导前脂肪细胞分化过程中的表达水平，发现在诱导3T3-L1成脂过程中，随着诱导天数的增加，IGF1R的蛋白表达水平逐渐增加，并在第6天达到高峰，第9天略有下降;miR-143水平呈上升趋势，而IGF1RmRNA与其相反，表达呈下降趋势，我们得出结论miR-143在脂肪细胞分化中表达上调，其靶基因IGF1R表达下调;然后我们将miR-143 mimics和miR-143 inhibitor转染至细胞中，发现转染了miR-143 mimics组细胞的脂滴明显多于inhibitor组。另外，我们收集了正常人群、代谢正常健康性肥胖者、代谢异常性肥胖者的血清，采用RT-qPCR技术比较miR-143的表达差异，发现与正常人群相比，miR-143在代谢正常健康性肥胖者表达较多。 结论： 1.IRS-1基因剔除可导致miR-143表达下调进一步使其靶基因IGF1R表达上调而参与细胞的代谢。 2.miR-143在前脂肪细胞成脂诱导过程中表达上调，并在代谢正常健康性肥胖人群血清中表达丰富。
IRS-1基因;miR-143;前脂肪细胞;细胞分化
中南大学
硕士
临床医学
周后德
2014
中文
R589;R361.3
62
2015-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）