二氧化硅诱导的肺泡巨噬细胞内质网应激与凋亡机制研究
背景与目的:硅肺是由于长期吸入大量游离二氧化硅粉尘所致，以肺部广泛结节性纤维化为主的疾病，是尘肺中最常见、进展最快、危害最严重的一种类型。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是以内质网腔内的未折叠或错误折叠蛋白聚集和钙离子平衡紊乱为主要特征，短期的内质网应激对细胞是一种保护作用，在严重和长期的内质网应激下，未折叠蛋白反应(unfolded proteinresponse，UPR)激活导致细胞凋亡通路。本研究主要探讨SiO2是否诱导肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AM)发生内质网应激并介导凋亡(Apoptosis)。 方法:(1)以200μg/ml SiO2刺激的RAW264.7细胞为模型，作用时间点为0小时、6小时、12小时、24小时、48小时，透射电子显微镜观察细胞超微结构改变，实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)及蛋白印迹法(Western blot)分别检测内质网应激标志物免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein，CHOP)的表达;(2)同时MTT法检测细胞增殖，DAPI染色、流式细胞术及cleaved caspase-3检测细胞凋亡;(3)抑制实验以不同浓度的内质网应激阻断剂4-PBA（4-Phenylbutyric acid）干预后，检测内质网应激相关指标以及凋亡改变。 结果:(1)200μg/ml SiO2诱导细胞后，电镜示细胞外形不规则线粒体增多肿胀，内质网腔增大;(2) Real-time PCR及Western blot结果显示，BiP表达随诱导时间延长，6小时开始增高,12小时后降低，而CHOP表达随诱导时间延长，24小时开始增高，48小时达最高;(3) MTT法示SiO2处理组较对照组细胞生长曲线平坦，细胞增殖活性降低;DAPI染色后24-48小时出现凋亡细胞核浓缩、凋亡小体等现象;流式细胞仪检测随SiO2诱导时间延长，细胞凋亡率增高;Western blot检测cleaved caspase-3提示SiO2诱导后24小时表达开始增高，48小时达最高;(4)予以4-PBA干预后，Real-time PCR及Western blot检测BiP、CHOP表达均较SiO2处理组降低;(5) MTT法示干预组细胞生长曲线接近对照组，增殖活性远高于SiO2处理组;DAPI染色示干预组细胞核变圆，染色质水平变淡且均匀;流式检测干预组细胞凋亡率降低;且干预后cleaved caspase-3表达水平下调。以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论:SiO2可诱导RAW264.7巨噬细胞发生ERS，并介导凋亡的发生。
二氧化硅;肺泡巨噬细胞;内质网应激;凋亡机制;肺结节性纤维化
中南大学
硕士
基础医学
胡永斌
2014
中文
R135.2
64
2015-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）