烟草DAD1基因功能初探
程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是由多基因控制的细胞自主有序的死亡过程，能够维持生物内环境的稳定。动物抗细胞凋亡基因（defender againstapoptotic cell death，DAD1）被认为是细胞凋亡的负调控基因，具有拮抗PCD的能力，可能在Bcl-2蛋白下游发挥作用。之后研究发现DAD1是寡聚糖转移酶（oligosaccharyltransferase，OST）复合物的亚基组分，其缺失将影响蛋白质的N-糖基化。DAD1基因在植物中的直向同源物可能影响植物生长发育，并在抵御PCD中发挥作用。本研究通过模式植物烟草，初步探索DAD1基因的生物学功能，以期为研究DAD1功能作用的分子机制奠定基础，具体研究如下: 从本氏烟分离出NbDAD1 cDNA序列，全长351bp，编码的蛋白质在动植物中均十分保守，具有3个疏水性跨膜区域。qRT-PCR分析发现NbDAD1基因在本氏烟根、茎、叶、花及不同发育阶段的叶中均表达，且根与茎中NbDAD1基因表达水平高于叶与花;随着叶片的衰老，Nb DAD1基因表达水平逐渐增高。 应用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术沉默本氏烟中NbDAD1 cDNA C端片段及全长，不同苗龄的本氏烟植株呈现不同沉默表型:注射时达10叶期的沉默植株与对照植株相比，植株矮小、根生长减缓，新叶叶色深绿、大部分花败育，顶芽转变花芽，腋芽数明显增加;注射时6叶期的沉默植株基本生长停滞、老叶黄化，顶芽转变为花芽，未观察到花器官，腋芽明显减少。相关生理生化指标分析发现Nb DAD1基因沉默的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素c含量及POD酶活均较未沉默植株均有所提高，其中POD酶活显著增加。应用qRT-PCR分析沉默植株和TRV对照植株中NbDAD1基因表达，发现沉默植株的表达高于对照植株，推测可能是本氏烟中还存在冗余基因DAD2，对植株DAD1基因沉默后进行代偿。此外，我们检测了沉默植株和TRV对照植株中YUCCA6、PIN1（IAA合成中关键酶关键基因）、IPT、AHK2、AHK3、ARR4（CTK合成关键酶基因）、CCD7、CCD8、BCR1（SL合成关键酶基因）以及BR合成关键酶基因CPD、DET1基因表达。 将本氏烟DAD1基因分别构建至超表达载体、携带HAtag标签的超表达载体及RNAi载体，通过根癌农杆菌介导叶盘法转化本氏烟，并经潮霉素筛选获得抗性植株。结果发现:本氏烟植株超表达抗性植株与转入空载的对照植株无明显表型差异;携带HAtag标签的超表达抗性植株叶片肥厚，茎干粗壮，花器官数目多，腋芽明显减少;RNAi抗性植株主茎细小、新叶叶色深绿、老叶生长停滞，大部分花败育，分蘖数和腋芽数显著增加;对本氏烟RNAi抗性植株及对照植株石蜡切片观察，发现RNAi抗性植株茎中木质部所占比例明显增大，叶片海绵组织增厚，花中可见发育不完全的胚珠。将普通烟草品种W38 NtDAD1同源基因分离、构建超表达载体、携带HAtag标签的超表达载体及RNAi载体及遗传转化W38的相关研究仍在进行中。 此外，通过热不对称交错式PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)法分离到的Nb DAD1基因ATG上游序列2400bp，其中约1000bp的序列与NtSuRB基因相似度达86％，后续相关工作仍在进行中。
本氏烟;普通烟草;负调控基因;DAD1基因;生物学功能;启动子
浙江师范大学
硕士
植物学
杨莉
2014
中文
S572.03;S336
66
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）