一种可视型分子筛体系的构建及亮氨酸拉链作为影响蛋白构象工具的初探
分子筛层析是蛋白分离纯化或者蛋白分子量测定的一种常用方法。它利用有筛孔的球状凝胶为固定相，分子量较大的蛋白无法进入筛孔中，所行路径较短流出较快，分子量小的蛋白因进入筛孔，行程较长最后流出，从而能够依据蛋白分子量的大小来分离、分析蛋白质。这种层析技术不仅被广泛应用于科学研究，也是各生物类院校对本科生和研究生安排的生化实验。 利用各类荧光蛋白具有不同颜色的特性，我们将不同颜色RFP、CFP、YFP、GFP四种荧光蛋白基因排列组合，构建到原核表达载体中，通过亲和层析，纯化得到一系列分子量大小不同颜色各异的蛋白。其中，红色RFP大小26.9kDa，橘色的RC大小54.9kDa，粉色的YRY大小84.3kDa，绿色的PKⅡ-GFP大小168.1kDa（大肠杆菌丙酮酸激酶PKⅡ为二聚体）。所得融合蛋白均有较好的可溶性和较强稳定性，颜色差异比较明显，无需光照、激发等其他外界条件。后经过分子筛(superdex200)分离检测，结果显示，蛋白上柱后可视效果明显，条带区分较清晰，证实纯化的蛋白可以作为可视的分子筛Marker使用。本研究不仅扩宽了荧光蛋白的应用范围，同时也对分子筛层析的实验教学工作有所帮助。 分子筛分离蛋白时，除与蛋白质分子量大小有关，还与蛋白质的形状有关。蛋白接近球形时其效果最好。上述四种可视分子筛Marker均为链状蛋白，在应用时有缺陷和局限性，若想这些分子筛Marker有更精确的效果，我们需要寻找一种能够改变蛋白构象的工具。 为分析亮氨酸拉链作为影响蛋白构象的工具，我们设计正反两个走向的亮氨酸拉链（源自酵母的转录因子GCN4），连在中间含3C酶切位点的ECFP和EYFP的两端，并以无亮氨酸拉链的pET23a(+)-CFP-3C-YFP为实验对照组。纯化所得蛋白经3C蛋白酶充分酶切后，进行FRET检测。结果表明含相反走向亮氨酸拉链的融合蛋白，在经过蛋白酶切后仍可观测到FRET现象，而含相同拉链走向和不含拉链的蛋白则无。这说明亮氨酸拉链可以作为一种改变蛋白构象的工具。 为进一步优化此工具，探究亮氨酸拉链通过二聚化改变蛋白构象所需的最短长度，我们缩短了拉链的碱性区长度进行实验。结果在酶切后无法再检测到FRET现象。这表明，其碱性区对亮氨酸拉链的二聚化有重要作用，当缩短后便无二聚化功能;减少一个单元（去除了后7个氨基酸）也无法再观察到FRET现象。此结果表明，若要此工具在原核表达情况时发挥改变蛋白构象的功能，需不少于四个拉链区的存在。 以上工作的完成，为我们今后进一步完善可视型分子筛体系以及利用亮氨酸拉链影响蛋白质构象奠定了基础。
分子筛层析;荧光蛋白;二聚体;亮氨酸拉链;蛋白分离纯化
浙江师范大学
硕士
植物学
孙梅好
2014
中文
Q518.1;O658.11
76
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）