慢性阻塞性肺疾病患者口腔及呼吸道内定植菌群的检测及同源性分析
目的 牙周炎是一种慢性感染性疾病。研究已发现，牙周炎与全身多器官或系统的感染性疾病有关，如心脑血管疾病、糖尿病、消化道和呼吸道疾病等。近年来，牙周炎与呼吸道疾病之间的关系备受关注，尤其是牙周炎与慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）之间的关系。本研究通过流行病调查，探讨牙周指标与肺功能指标之间的相关性，同时检测急性加重期COPD(Acuteexacerbation-COPD，AE-COPD)患者口腔及呼吸道内定植菌群的相对含量，分析其同源性。并对呼吸道内定植菌群的相对含量与牙周指标及肺功能指标的相关性进行分析，进一步探讨牙周炎与慢性阻塞性肺疾病之间的关系。 方法 一、研究对象 收集辽宁省沈阳市中国医科大学附属第一医院、盛京医院、第四医院和沈阳市八院2008年10月至2009年4月确诊为COPD的患者266例，其中稳定期COPD患者160例，急性加重期COPD患者106例，并收集106例AE-COPD患者的龈下菌斑及痰标本。 二、研究方法 （一）牙周炎与慢性阻塞性肺疾病之间的流行病学研究 1、口腔健康检查 检查并记录所有研究对象六颗指数牙16、11、26、31、36、46的简化口腔卫生指数(Simplifiedoralhygieneindex，OHI-S)、龈沟出血指数(Sulcusbleedingindex，SBI)、牙周探诊深度(Probingdepth，PD)、临床附着丧失(Clinicalattachmentloss，CAL)。 2、口腔问卷调查 问卷内容除性别、年龄等一般情况外，主要包括烟酒行为、刷牙习惯、糖尿病史、高血压史和COPD病史（年）等。 3、肺功能指标的检查 采用肺功能仪测试并记录患者的一秒钟用力呼气容积占预计值比例(Forcedexpiratoryvolumeinonesecondpercentageofpredictedvalue,FEV1％。 （二）慢性阻塞性肺疾病患者口腔及呼吸道内定植菌群的检测 (1)采用常规酚-氯仿抽提法抽提细菌DNA。 (2)实时荧光定量PCR扩增AE-COPD患者龈下菌斑及痰标本中的定植菌群，反应结束后由随机软件SequenceDetectionSystem(SDS)根据标准曲线自动给出每个目标DNA片段数据。 （三）慢性阻塞性肺疾病患者口腔及呼吸道内定植菌群的同源性分析 (1)使用温度梯度PCR仪筛选最佳反应条件进行常规PCR扩增，将PCR产物电泳分离及纯化，然后将PCR产物转化挑取克隆。 (2)16SrDNA序列测定及同源性分析:将测得的序列输入GenBank，用Blast程序寻找相似性最高的16SrDNA序列，将序列用ClustalW2.0软件进行多序列比较，建立系统进化树，根据进化树得到相似序列，利用Blast分析同源性。 （四）AE-COPD患者呼吸道内定植菌群与牙周指标及FEV1％的相关性分析。 三、统计学方法 应用统计学软件SPSS17.0进行统计学分析。对于计量资料，数据呈正态分布时，均数用mean±SD表示，两组比较采用独立样本t检验;数据呈非正态分布时，均数用中位数表示，组间比较时用秩和检验。计数资料比较使用X2检验。运用Logistic回归模型进行多因素分析。P＜0.05为有差异有统计学意义。 结果 一、牙周炎与慢性阻塞性肺疾病之间的流行病学研究 (1)AE-COPD组的吸烟率47.2％，明显高于稳定期COPD组(P=0.000)。 (2)AE-COPD组的SBI、PD及CAL指数明显高于稳定期COPD组(P=0.000)。 (3)AE-COPD组的OHI-S、SBI、PD及CAL均与FEV1％呈负相关(r=-0.309，p=0.002;r=-0.333,p=0.001;r=-0.395,p=0.000;r=-0.702,p=0.000)，其中CALl与FEV1％的相关性最强;稳定期COPD组CAL与FEV1％呈负相关(r=-0.657,p=0.000)。 二、慢性阻塞性肺疾病患者口腔及呼吸道内定植菌群的检测 （一）龈下菌斑及痰标本中定植菌群的单独检出情况 (1)龈下菌斑内定植菌群的单独检出:106例受检者的龈下菌斑中，呼吸道致病菌(Pa,Kb，Sp)的检出率最高，为83.0％，明显高于其它细菌;其次为橙色复合体(Fn,Pi)，检出率为77.4％，红色复合体(Tf,Pg，Td)的检出率最低，为30.2％。 (2)痰标本内定植菌群的单独检出:106例受检者的痰标本中，呼吸道致病菌(Pa,Kb，Sp)的检出率最高，为95.3％;其次为红色复合体(Tf,Pg，Td)，检出率为86.8％;绿色复合体的检出率最低，为34.0％。 (3)痰标本中红色复合体及呼吸道致病菌的检出率明显高于龈下菌斑，差异有高度统计学意义(P=0.000);而痰标本中的绿色复合体的检出率明显低于龈下菌斑，差异有高度统计学意义(P=0.002)。 (4)吸道内红色复合体与绿色复合体及呼吸道致病菌的关系密切，改变红色复合体可能会影响绿色复合体及呼吸道致病菌在呼吸道内的定植。 （二）龈下菌斑及痰标本内定植菌群的协同检出情况 (1)龈下菌斑中红色复合体与呼吸道致病菌的协同检出率最高为86.8％，其次为橙色复合体与呼吸道致病菌，协同检出率为70.8％，黄色与绿色复合体的协同检出率最低为26.4％。 (2)痰标本中红色和橙色复合体，红色和黄色复合体，红色和呼吸道致病菌协同检出率明显高于龈下菌斑(P=0.000)，痰标本中的橙色和绿色复合体，黄色和绿色复合体协同检出率明显低于龈下菌斑。 （三）龈下菌斑及痰标本中定植菌群的相对含量 龈下菌斑中橙色复合体的相对含量明显高于痰标本，差异有高度统计学意义(P=0.010)，而龈下菌斑中的呼吸道致病菌的相对含量明显低于痰标本，差异有高度统计学意义(P=0.002)。 三、慢性阻塞性肺疾病患者口腔及呼吸道内定植菌群的同源性分析 （一）序列Blast结果 将序列输入Genebank，Blast结果显示PseudomonasaeruginosastrainGSM316SribosomalRNAgene，partialsequence检出率最高为12.5％，其次为PseudomonasaeruginosaPAO1，completegenomeGQ037498.1检出率为10.0％，第三为Streptococcuspneumoniae670-6B，completegenome检出率为9.4％，Aggregatibacteractinomycetemcomitansgenefor16SribosomalRNA,partialsequence，strain:JCM8578检出率为6.6％。 （二）同源性分析结果显示 具有同源性的序列占所有相似性序列的76.9％，其中PseudomonasaeruginosaUCBPP-PA14,completegenome;AggregatibacteractinomycetemcomitansD11S-1,completegenome;StreptococcuspneumoniaeAP200，completegenome均具有同源性。 四、采用统计学方法研究痰标本内定植菌群与牙周指标及FEV1％之间的相关性 （一）痰标本中定植菌群检出率与牙周状况及FEV1％的相关性分析 (1)吸烟者中呼吸道内的黄色复合体及绿色复合体的检出率明显高于不吸烟者(P=0.001，P=0.041)。 (2)通过独立样本t检验比较痰标本内5种复合体检出阳性与阴性者的牙周炎症水平，结果显示:4种复合体的检出水平均与牙周炎症程度有关，其中，与SBI密切相关的是绿色复合体(P=0.008);与PD密切相关的是橙色复合体(P=0.022);与CAL密切相关的是红色及黄色复合体(P=0.044，P=0.007)。 (3)应用独立样本t检验的统计方法分别比较呼吸道内定植菌群检出阳性与阴性者的FEV1％，结果显示:红色复合体及呼吸道致病菌阳性患者的FEV1％明显低于阴性患者（P=0.021，P=0.000），提示呼吸道内红色复合体及呼吸道致病菌的检出率均与FEV1％有关。 （二）痰标本内定植菌群相对含量与牙周状况及FEV1％的相关性分析 (1)呼吸道内绿色复合体的相对含量与OHI-S呈显著正相关(R=0.782，P=0.001)，呼吸道致病菌的相对含量与SBI呈正相关(R=0.281，P=0.006)，黄色复合体的相对含量与CAL呈负相关(R=-0.538，P=0.000)。 (2)呼吸道内黄色复合体的相对含量与FEV1％呈正相关(R=0.332,P=0.034);呼吸道内绿色复合体的相对含量与FEV1％呈负相关(R=-0.507，P=0.019)。 结论 (1)吸烟作为牙周炎和COPD的共同危险因素，在牙周炎和COPD的发生和发展中发挥很重要的作用。 (2)AE-COPD患者的OHI-S、SBI、PD和CAL指数均与肺功能指标呈负相关，其中CAL与肺功能指标的相关性最强，提示牙周炎与COPD之间有一定相关性。 (3)AE-COPD患者口腔和呼吸道内同时检测到口腔复合体及呼吸道致病菌，并且口腔复合体与呼吸道致病菌协同检出率较高。同时，呼吸道内红色复合体与绿色复合体及呼吸道致病菌的关系密切，改变红色复合体可能会影响绿色复合体及呼吸道致病菌在呼吸道内的定植。 (4)本实验成功构建了口腔及呼吸道细菌的系统进化树;呼吸道内定植的Sp、Pa、Aa和口腔内的Sp、Pa、Aa具有同源性。 (5)AE-COPD患者呼吸道内定植菌群与牙周指标及肺功能指标有关。
慢性阻塞性肺疾病;牙周炎;呼吸道;定植菌群;含量测定
中国医科大学
博士
口腔临床医学
潘亚萍
2011
中文
R781.6
76
2014-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）