猪圆环病毒2型Cap基因工程疫苗的研制
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)近年来在我国呈高发态势，给我养猪业造成了严重的经济损失。PCV2主要入侵淋巴系统引起免疫抑制，临床上多为隐性感染，常常并发或继发其他病毒或细菌病。目前，有关PCV2的疫苗的研究国内外多有报道。商品化疫苗仍以灭活疫苗为主，当前PCV2的灭活疫苗和弱毒活疫苗在抗原制备、抗体滴度、安全性等方面仍存在一定的不足，PCV2亚单位疫苗和重组疫苗因其安全性、经济性和良好的免疫诱导效果成为近年来成为研究热点。 本研究首先开展我国猪圆环病毒的流行状况研究，10个省市300个样品的检测结果显示，PCV2的阳性率平均为85％(65％～92％)，这一结果表明我国猪群PCV2的感染非常普遍。进一步开展分子流行病学研究发现，我国近年来流行的主要毒株基本为PCV2b亚型。本研究检测的28株毒株中，属于PCV2b亚型的有27株，占96.4％，属于PCV2a的有1株，占3.6％。同源进化分析显示，毒株之间同源性为97.6％～100％，与参考毒株的同源性为88.3％～100％。 鉴于此，本研究以分离的2b亚型毒株PCV2-SL13为参考毒株，采用真核表达质粒和人腺病毒载体分别重组猪圆环病毒2型Cap基因制备基因工程疫苗。首先，通过PCR扩增出PCV2 Cap基因。其次，将扩增的Cap基因片段与空质粒载体pcDNA4/HisMax连接，获得了可表达Cap基因的真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap。将30只4～6周龄Balb/c小鼠随机分成3组，每组10只，第Ⅰ组注射pcDNA4/HisMax-Cap重组质粒，第Ⅱ组注射pcDNA4/HisMax，第Ⅲ组是注射PBS溶液，每只肌肉接种100uL，共免疫3次，每次间隔2周，分别于免疫第0、7、14、28、35、49天采集小鼠血清，用间接ELISA方法检测血清中的IgG抗体。结果显示，在第49天，重组质粒组的抗体滴度可达0.44，空白质粒组和PBS组的抗体滴度分别为0.28和0.20。 再次，本研究将PCV2b亚型毒株PCV2-SL13的Cap基因片段连接到人5型腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA上，并同腺病毒骨架载体RAPAd(@)Ad Backbone vector共转染293细胞获得重组腺病毒rAd-Cap，测定其TCID50为1010.6。 本研究成功构建了真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap和重组腺病毒rAd-Cap。动物试验表明，真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap可诱导产生猪圆环病毒的抗体，可以作为疫苗的有效候选基因。构建的重组腺病毒rAd-Cap，大大提高了病毒的生产滴度。本研究初步研制了2种猪圆环病毒基因工程疫苗，为下一步猪圆环病毒2型Cap基因亚单位疫苗和重组腺病毒疫苗的生产应用研究奠定了基础。
猪圆环病毒2型;Cap基因;基因工程疫苗;抗体检测
山东农业大学
硕士
兽医
柴同杰
2014
中文
S858.28;S852.5
54
2014-10-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）