Nrf2/ARE信号通路在纳米二氧化钛诱导HepG2细胞氧化损伤中的作用研究
目的:纳米二氧化钛(nanoparticle titanium dioxide，Nano-TiO2)是纳米材料的一种，因其具有一系列优异的物理化学性质，使其在医药、化工、环境保护、化妆品、塑料、油漆等领域得到广泛的应用。但是近年来大量研究发现氧化应激参与Nano-TiO2对机体的毒性作用，引起DNA损伤、细胞毒性、炎症反应等，对人体健康产生损害作用。虽然纳米材料造成的氧化应激与其毒性高度相关，但其作用靶点和调控机制不清。由于Nrf2/ARE通路是细胞抗击氧化应激的关键步骤之一，因此探讨Nrf2/ARE信号通路在纳米材料导致健康损坏效应中的重要作用及其具体的作用机制就具有十分重要的意义。本文拟通过观察Nano-TiO2染毒对HepG2细胞抗氧化功能和DNA损伤的影响，以Nrf2/ARE信号通路为切入点，对纳米材料的毒作用机制进行深入研究，探讨纳米材料导致细胞毒作用靶点，寻找切实可行的预防控制方法。 方法: 1细胞培养及细胞模型建立 人肝母细胞瘤细胞株HepG2（中国武汉典型培养物保藏中心）于含10％热灭活小牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度下培养。选对数生长期的细胞，用粒径为25nm的Nano-TiO2染毒处理24小时，剂量为0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL;以DMEM为阴性对照。 2细胞形态学观察 通过生物显微镜观察染毒前后HepG2细胞组织形态的改变。 3细胞氧化损伤指标的测定 生化试剂盒检测HepG2细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。 4流式细胞术检测荧光探针标记的ROS水平 以2，7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)作为荧光探针，采用流式细胞检测技术检测不同剂量的Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后细胞内活性氧(ROS)含量。 5彗星试验检测DNA损伤 应用彗星试验检测HepG2细胞DNA损伤程度。 6 Nano-TiO2对HepG2细胞内ARE表达水平的影响 pARE-LUC质粒和PRL-TK质粒共转染HepG2细胞，转染后6小时以不同浓度的Nano-TiO2对细胞进行染毒，24小时后收获细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测样品中双荧光素酶的表达情况，以荧光强度/μg蛋白含量分别表示虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达量，ARE的表达以虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值表示。 7荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR测定Nrf2/ARE信号通路中Nrf2、HO-1、NQO1及γ-GCS基因mRNA水平的表达。 8 Western blot 采用Western blot方法检测Nrf2/ARE信号通路中Nrf2、HO-1、NQO1、及γ-GCS蛋白表达情况。 结果: 1 Nano-TiO2对HepG2细胞形态的影响 生物显微镜下观察的结果显示:正常培养的HepG2细胞为菱形，贴壁伸展紧密生长，折光率高，增殖旺盛。经染毒处理后:细胞数减少，细胞皱缩为圆形、折光率减弱，贴壁能力下降，多数脱落漂浮于培养液中。 2 Nano-TiO2对HepG2细胞氧化损伤的影响 不同剂量Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，随着染毒浓度的增加，MDA含量逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05); SOD活力逐渐降低，0.1μg/mL剂量组和对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05），1μg/mL和10μg/mL剂量组与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05); GSH-Px活力逐渐降低，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05); ROS水平逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05）。 3彗星实验检测Nano-TiO2对HepG2细胞DNA损伤的影响 不同剂量Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，随着染毒浓度的增加，各剂量组Olive尾矩显著增加，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05）。 4 Nano-TiO2对HepG2细胞内ARE表达水平的变化 不同剂量Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，随着染毒浓度的增加，ARE表达逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并有良好的剂量-反应关系(r=0.999，P＜0.05)。 5 Nano-TiO2对HepG2细胞中的Nrf2、NQO1、HO-1、γ-GCS等基因mRNA表达水平的影响 不同剂量Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，HepG2细胞中Nrf2、NQO1基因mRNA表达水平随着染毒浓度的增加均逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05); Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，HO-1基因mRNA表达水平随着染毒浓度的增加而升高，但当染毒浓度为10μg/mL时较0.1、1μg/mL时略有降低，各剂量组与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05); 0.1、1μg/mL Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，γ-GCS基因mRNA表达水平随着染毒浓度的增加而升高，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）;当染毒浓度为10μg/mL时，γ-GCS基因mRNA表达水平降低，与对照组相比，差异无显著性(P＞0.05）。 6 Nano-TiO2对HepG2细胞中的Nrf2、NQO1、HO-1、γ-GCS等蛋白表达水平的影响 0.1、1μg/mL Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，Nrf2蛋白表达水平随着染毒浓度的增加而升高，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05);当染毒浓度为10μg/mL时，Nrf2蛋白表达水平略有降低，与对照组相比，差异无显著性(P＞0.05）; 不同剂量Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，HepG2细胞中NQO1蛋白表达水平随着染毒浓度的增加均逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）; 0.1、1μg/mL Nano-TiO2处理HepG2细胞24h后，HO-1、γ-GCS蛋白表达水平随着染毒浓度的增加而升高，当染毒浓度为10μg/mL时，HO-1、γ-GCS蛋白表达水平降低。各剂量组与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05）。 结论: 1纳米二氧化钛染毒后，可以使HepG2细胞的抗氧化功能受损，使机体出现氧化应激。 2纳米二氧化钛染毒后，可以诱导HepG2细胞发生DNA损伤。 3纳米二氧化钛染毒后，HepG2细胞的抗氧化反应元件ARE表达水平升高，发挥抗氧化作用。 4纳米二氧化钛染毒后，Nrf2/ARE信号通路被激活，并启动下游多种保护性基因的表达。低水平的氧化应激会诱导保护性反应的发生，而当氧化应激过高时，有些保护性抗氧化系统失调，相应的抗氧化反应蛋白可能会失去了保护作用。
纳米二氧化钛;氧化应激;HepG2细胞;DNA损伤;抗氧化功能;毒作用机制
河北医科大学
硕士
卫生毒理学
张荣
2014
中文
R114
61
2014-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）